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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:30 编辑 4 C: x, w& |1 P- ^4 P# M
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 1 z+ n. ^4 b5 T
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 : @: m' |, F- p- F
4 R: d, x5 Q2 M9 K O* C( }
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
j6 ]5 M$ f0 [- d9 y% C2 O3 s$ W把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
; }6 h3 |5 s: m" [9 Q- }吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
& I" d4 H+ u, b2 N! [: b根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
2 V+ h( a; q6 ~7 T* U% [# V/ H0 w2 K/ g滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
1 \# `& n$ h4 W2 C( `把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 " f5 j! Q& j( L1 C {
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 6 ~3 D* [, Q# ^1 x' m7 z9 }
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 . p4 v5 c+ Y$ {) T% \
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 8 O0 T) K O+ B/ z2 j
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
+ b! o9 K& D% D2 ]8 b' F2 U小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 " J/ m# t) g- D( V' Q8 r
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
& j6 r/ I* X5 |8 Y7 ~& P把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 ! ~+ I' u- D/ ?
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
$ {6 [- d- u s0 t9 W N9 v根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 3 P" [0 D k! _! Q. `5 s7 a5 X
小鼠胚胎干细胞的传代 : c5 b9 i3 s! g# F$ d2 f
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
h7 h5 s* m% s用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 & S% Z1 K" a8 I7 l! _/ h
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
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发表于 2011-2-15 19:17
