质粒电转问题

lorey

最近做了一次电转的实验，就是将一个带GFP和Neo的质粒转入成纤维细胞中。
- q+ S  b; {% W' U& i  |3 t电转后，没有马上用G418筛选，养了四五天后，细胞长了满板，但是GFP不亮。后来用G418筛选，开始时800ng/ml大筛了两天，后用400ng/ml，结果过了两天后，细胞就全飘起来了。: m# o0 A, _4 C6 ^' E; t! m  g
很明显的，是质粒没转进去，可是当时电转时，程序和质粒都没有问题的，为什么没转进去呢？帮我电转的人是很熟练的人啊！

frank110

没马上用G418筛选，就算你的质粒转进去了，没有一个外界的生存压力，质粒在细胞内复制会变慢导至丢失，估计几天后你所转的细胞已经丢失了质粒，对G418敏感，再用其筛选，细胞就会死亡。

zuming

电转后马上用G418筛选是必需的！

绿雪

瞬时转染24-48h是外源基因表达的高峰期，其后便逐渐减弱至消失，一般5-7d就不能再表达外源基因了。所以最好在转染后24-48h加药物进行筛选。
. x/ t4 D* M% d9 l' a: N. N+ G另外，转染后培养皿中还有部分细胞是没有转染到的，这部分细胞相对于转染的细胞要生长得快一些，所以，如果不加药物的话，没转染的细胞很快就会把转染的细胞排挤掉的。
# ]8 T* f: s0 T# ~( U5 E( n$ k药物筛选时保证细胞有一定的密度和生长空间是很重要的。

lorey

谢谢各位解惑！
4 `3 y" ^3 M  g) P我是不是可以理解为，转基因质粒必须要有抗性筛选标记的？还是针对于电转而言？
8 ]% }) M% c$ [# T7 j另：在做iPS时，病毒感染似乎都不涉及筛选问题，而且似乎一直都表达外源基因，是因为它的整合率高？启动子？还是其他的原因？

qizhi502

回复 lorey 的帖子* F$ n2 s) {7 A9 L5 I
  m$ x* ~9 p7 T1 H3 a. o1 \! F
与你的筛选没有很大的关系，你的目的是想让外源基因整合到基因组中，既然筛选后细胞都死了，说明质粒上的基因没表达，也就是没有整合到基因组中，所以应该是电转过程或质粒构建的原因，最好做个阳性对照。

shewawa

回复 lorey 的帖子+ ?/ F4 D1 [5 H6 h. X' c3 H
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回答iPS部分，iPS细胞不是一直都表达外源性基因，感染后的传代过程中会发生外源性的gene silencing,这时候表达的是内源性的基因了。这个原理不太清楚。不过iPS制作过程中的virus titer确实要求很高，可能这个也有关系吧。。。

trl137

电转后，最好在24-72小时之内加G418筛选，在此期间，是外源基因的表达高峰期（瞬时转染）。
  {$ q( g8 A* f一般说来，筛选细胞所用的G418的筛选浓度可持续用7天左右，也就是你所用的800ug/ml，而维持浓度大家通常都是在筛选浓度的基础上减半，其实不然，有时候可根据自己的经验，或者依据细胞生长的状态适当地调整，稍高些较好。
8 t( a' H4 R+ X! m) B8 x/ m* c未转基因的细胞往往抑制了转基因细胞的生长，所以一旦推迟加药时间就会大大影响效率，细胞大量死是很正常的。1 {4 L2 B2 O7 W; E
并不是所有的转基因质粒都带有抗性筛选标记，比如现在研究的比较热的锌指核酸酶。$ _6 H  Q! n# c5 Z3 ]

siyue13

呵呵，再转一次吧，多电几次就知道了

钻石星辰

回复 shewawa 的帖子
9 n: G  A7 {% ~% @7 i# |2 l0 w! {1 D
仅对于病毒法诱导的iPS：病毒携带的外源基因是会随着reprogramming的进行而沉默，原因是de novo DNA Demethylatioin。不过也有重新激活的危险，这就是为什么Virus-iPS 通过tetraploid complementation获得的小鼠有一定的癌症发病率，可能是由于外源c-myc或klf4基因被重新激活。; g, D+ {3 h8 K* R

; X, s4 G, ?/ n7 \# r$ `- H而其它通过Transposon等诱导的iPS，如果不将Transposon导出的话，外源基因会一直表达。