大家帮我看看小鼠MSC免疫荧光图片

feifei105

我培养从小鼠附睾处脂肪垫提取间充质干细胞，作RT-PCR发现有我目的蛋白表达，后作荧光染色（见下图），确实有阳性细胞，但很少（我知道消化法分离的脂肪来源的MSC混有很多杂细胞），所以目前不知所措，首先阳性细胞是间充质干细胞吗？它比背景细胞要小。如果是间充质干的话，我又怎么证明目的蛋白表达的是在MSC，不是成纤维什么的呢？我难道要用CD29+ 目的蛋白+；CD44+ 目的蛋白+；CD90+ 目的蛋白+；CD45- 目的蛋白-；CD31- 目的蛋白-双标做免疫荧光吗？还是我只要能够证实细胞阳性率在90%以上，有目的蛋白表达即可？: Z3 G; m( U  ]1 o/ L: P
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我同时分离了小鼠骨髓MSC，做RT-PCR也同样有目的蛋白表达，但还是同样问题。我怎么有效快速的知道我的阳性细胞是什么细胞？
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6 j; r8 x+ Q* p- `! B' iPS：我没有做流式检测，做诱导检测失败，正在找原因，重新配制诱导试剂
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feifei105

我自己顶一下，图片发上来有些模糊了

hanbing

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3 C2 P' z7 @0 Q+ f' |# N
- @4 r0 p3 }. B看看这个

hanbing

看看这篇文献

luoziwei

版主，你能不能先确定细胞是MSC，然后在这种细胞上再检测你的目的蛋白？MSC好检测嘛，然后你的目的蛋白的特异抗体，双标荧光，选择不同波长的激发光就可以了。

yuangaoqian

你实验的目的是什么？如果你想鉴定脂肪组织来源的细胞表不表达你的目的蛋白，只需要检测你的目的蛋白，通过免疫细胞化学或流式都可以，如果你要检测脂肪间充质干细胞中是否表达你的目的蛋白，你就需要先鉴定你分离细胞的纯度，含间充质干细胞的含量，然后通过间充质干细胞标志与你的蛋白共定位检测，间充质干细胞中是否有你的目的蛋白表达。所以，先要明确你的实验目的。

feifei105

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4 H* u; _6 F) u. G& J  C我最开始做实验分离间充质干的目的不是要证明是否有目的蛋白表达，但我偶然做RT-PCR发现有这个蛋白表达，但我不确定是表达在什么细胞上，如果费了九牛之力发现不是在这个细胞上，就白费了。所以想用抗体染色排除看看，发帖想让大家帮忙看看染色阳性的细胞形态像不像MSC或者有没有更好的办法证明。

feifei105

回复 yuangaoqian 的帖子! O+ E! z0 @) r( H& ?* G2 c
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我现在其实已证明无论脂肪来源还是骨髓来源都有我目的蛋白表达，但不确定表达在什么细胞上，想通过形态排除，抗体染色排除，想让大家帮忙看看有没有更好的办法。我的目的就是想先知道他表达在什么细胞上，然后我们实验室有敲除鼠，做些功能实验。谢谢你的建议。

feifei105

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9 d  W1 w5 V6 m1 D* A9 ]非常感谢

yuangaoqian

回复 feifei105 的帖子! U' P3 @8 n0 ]) t+ |& ^
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现在好多基因不只定位于一种组织或一种细胞中，你们做的敲除鼠是局部敲除还是特异性敲除呀？构建的敲除鼠跟正常鼠有什么区别没有？可以先通过敲除鼠与正常鼠之间的区别来推测一些它的更能。另外，这个蛋白之前没有研究过吗？可以先参照一下之前的研究结果，即使不是你想要研究的组织或细胞，都有一定的参考价值，最起码你可以确定大致的研究方向。
) Z  c0 [' @+ |& ?- Z: C此外，你想通过形态排除，我个人认为可能比较困难。脂肪组织来源的细胞包含多种类型的细胞，像你免疫荧光染色呈阳性的细胞形态为梭形，可能是干细胞、前体脂肪细胞或成纤维胞。
2 V' C" p0 |; L( ]3 U2 ~一点建议：如果这种蛋白的作用目前还没有相关的报道，你可以先通过生物信息学分析预测一下其功能以及上下游基因，再做进一步研究。否则太盲目了。
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