请教一个连接反应的问题

mckf111

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( }3 @6 ~4 \* J$ N+ n  ?( I9 x! Z( W; ]: w/ F* V
结果是8个克隆5个阳性或者更高。。。
* [; r9 ~/ S: d& K那如何浓缩DNA呢 洗脱的时候说明书上就是要25-30ul的洗脱液洗脱 那如何对洗脱下来的DNA浓缩？( d+ B& f% X1 c- K
MQ我们轻易不给用 穷。。。

ligangcw

连接了，跑电泳没了！看看两个片段的大小，是不是链接后太大没跑出来？做几遍了？若一遍的话，再试试，看看实验重复性！转了没长出来，感受态没问题，看来问题还在质粒上，感受态(可以试试碧云天的超级感受态制备试剂高效方便）

mckf111

回复 ligangcw 的帖子
* P) \1 ]  o4 H6 R. L0 F" [3 s: X" z" z; ]' }
不会太大跑不出来 我目的片段很小 就200多bp
( z* r) c( G; t% G3 N重复了三次 还是这样 我等下传张图上来

mckf111

2011-1-16 10:15 上传

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, l/ d3 |3 c/ U  k8 t/ e& q
第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp
7 s6 A; g! a6 j. w. Y( {( k9 \) C第三泳道是质粒+288bp目的片段
: S* X, `8 _& v! _& w. ?1 _第四泳道是质粒+570bp目的片段
& e+ k& v: B) {) V4 |: |. y5 h质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。
8 h3 r& ]: \& z6 h* r. s7 d这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。
6 A: g5 `/ K5 W, `P.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。

scl6682005

将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul - U- d8 }7 m( ]% `) a

7 l& @. V) J+ n! ^& r: s不建议连接后直接跑胶,还是要老老实实转化扩增后再检测.连接效率可能不高,所以连接后应该有三种片断:目的片段,载体，载体+目的片段。你只加了1ul质粒，所以载体，载体+目的片段可能都看不到。如果目的片段连接时串联的话，再稀释一下，琼脂糖的分辨率又不高，就都看不到了。  j3 u' e; r) i/ ~/ R. ]
以上分析是基于你的电泳没有问题的情况下。

chochochocho

  E4 L/ S2 q  _$ s0 W, }# \8 B$ R
, N6 T& a3 ~- G. u回复 mckf111 的帖子) \; w. d0 c$ @8 f& ~8 J% S  i- L  T

2 `9 ~0 F. T3 e1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。2 M" A( `6 a) K1 j( Z
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid2693451 _4 ?1 ^4 W1 s3 L* Z9 D) k3 e
2，MQ和dDW不是问题，不用在意。% j- {2 r7 p9 A4 A0 X
3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选3 E2 f* \* g; t
4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。
- \: k0 g, b$ z) ~5 `

chochochocho

- \9 h. b0 B6 u2 b
( b& V9 b. M1 [, s5 p4 P; K2 X
回复 scl6682005 的帖子, m( T( m8 f3 g  ?% R8 u3 N( l
8 q$ q4 X5 E: _2 b: d- b# n5 O7 x: s
个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug 做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。( @+ N( c3 l  q% e, }

绿雪

如果确实想拿连接产物鉴定是否连接上的话，可以那1ul的连接产物做模板跑个PCR，引物用载体通用引物。如果有连上的可以看到比插入片段稍大的条带。个人不建议用连接产物跑电泳来检测。

老虎菜998

连接反应不是问题的关键，关键还是DNA哪去了？如果电泳时没发现不进胶的情况，那就是DNA降解了。建议从这方面寻找原因。降解的可能有多种，最主要的有：连接酶及体系中有核酸酶污染，其次是反应管或回收导致的核酸酶污染。

ligangcw

还有你的电泳缓冲液似乎用的用的有点久了，想重复次数多些可用MQ水配制