请教一个连接反应的问题

mckf111

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上
3 l8 e' y3 k' a" L感受态问题已解决/ {0 {: ]8 z( Y- D+ s0 E. }7 ^
关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条* v' U/ n8 ?4 G" Y9 ]
可最终结果是——0条
* r9 E) s3 [% C  N2 ?哪位大牛能给我解释下7 c9 n1 x6 I0 x. H) e
P.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？

chochochocho

7 R- N0 U8 q* O1 N9 J/ ^4 j# o
( G% R# b$ a3 e3 A  J我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？

mckf111

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+ G7 I' `* O+ G0 G4 w2 i/ J! b& I. N" R# S3 W
我说了个大概 准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。7 w7 O/ G) t! y! l. e
可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。

chochochocho

回复 mckf111 的帖子$ M2 o6 r& }/ n; x8 y+ q* ]
- J0 U0 X$ p- ]
你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？

mckf111

0 \) u4 g/ ~- U! c5 L3 X  _  c0 H/ j4 L$ w& Y8 L/ X
回复 chochochocho 的帖子5 O2 _/ F1 y, O$ a
, J! G6 R: Y5 h* @5 S8 R, M! d2 u2 ]
谢谢 目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的 应该是Tris 那MQ是什么？
" c8 i7 M' K2 _  r( x) x但不管咋样 我加进去的DNA怎么都看不到呢 我很疑惑。。。

chochochocho

7 ]- S/ _& d+ k7 O
$ l" w( x) u% X, \$ O1 O$ mMilli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？

mckf111

回复 chochochocho 的帖子9 k8 E- S* U! P' P5 q! S, ?
5 A& z) i$ L  K3 c! l" \
原来是超纯水啊～～
& F* [9 @# S7 B. i6 N做了电泳啊 咱这分光计坏了 没具体去测 但用5ul跑出来 质粒和目的基因亮度相当 而且有一般内参那种亮度 我想浓度应该不会差的
2 R/ S: X! K1 R3 h8 e“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白 求详

chochochocho

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。* _& P- a$ L8 M' x, j
比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul； 要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。

mckf111

回复 chochochocho 的帖子/ I* }6 @0 V# w

* K% ]& L9 _6 d/ Z那会不会导致因目的片段太少 连接产物过少啊 不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。
- q3 C: Y0 Q! a( I/ k, _+ Z! r: @另外 剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候 都不加水的 把目的片段代替水猛加。。。

chochochocho

你们都是猛人结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。