请教一个连接反应的问题

mckf111

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上. E% b+ P$ h: d
感受态问题已解决
8 H  L, Z" T% P) N6 Z& ]关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条
6 e! \7 B9 M% k/ Y7 c, @! ]可最终结果是——0条) w3 |, q& D' _5 I1 _& y. Q9 d0 f5 G
哪位大牛能给我解释下
- u- [! k! o$ M' c% N4 X5 e' m6 pP.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？

hughliang

记得分子克隆上说，如果用EB，50ngDNA可以显影。
7 T3 T6 w1 h9 M1 I, o$ f2 e
! Y# k& c2 K& I  K3 y如果连接效率不够高，连接后的片段不到50ng，看不见很正常，所以没有必要用跑胶来检查连接效果。) N. X8 }1 B9 K4 v% R
( O# e; J$ ]4 {! C( l$ |" d# z
可是看不见你的载体和插入片段就有点奇怪了。

ligangcw

还有你的电泳缓冲液似乎用的用的有点久了，想重复次数多些可用MQ水配制

老虎菜998

连接反应不是问题的关键，关键还是DNA哪去了？如果电泳时没发现不进胶的情况，那就是DNA降解了。建议从这方面寻找原因。降解的可能有多种，最主要的有：连接酶及体系中有核酸酶污染，其次是反应管或回收导致的核酸酶污染。

绿雪

如果确实想拿连接产物鉴定是否连接上的话，可以那1ul的连接产物做模板跑个PCR，引物用载体通用引物。如果有连上的可以看到比插入片段稍大的条带。个人不建议用连接产物跑电泳来检测。

chochochocho

5 P3 @, _9 _) u4 E
! {# G% e7 k$ w- |回复 scl6682005 的帖子) F$ \" }1 \8 u

0 z- Z$ N  ~+ m% E/ P个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug 做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。4 k, [! w2 X) d" r# j6 c% q" x3 z

chochochocho

5 a2 R" \3 ]% H
4 Q4 Y7 ~' Q0 U, d( ^1 B0 O回复 mckf111 的帖子
  |2 O- N0 }8 ?* v; s& Z7 e3 R; ?
* a  U: u: H, }3 V! d1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。3 r: ~2 Q+ A6 K; V8 [& a4 b" \* m
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid269345
7 G+ A/ q4 n. Z# \( {1 T* B" w3 L2，MQ和dDW不是问题，不用在意。9 G/ B. P$ ~0 \/ K
3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选: |0 ]. R: c$ ~. {4 ^7 s
4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。0 C$ K& ~! D2 \# u, ?/ ~

scl6682005

将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 7 s/ K2 I& @5 ^
- i" H6 K: F/ D% D
不建议连接后直接跑胶,还是要老老实实转化扩增后再检测.连接效率可能不高,所以连接后应该有三种片断:目的片段,载体，载体+目的片段。你只加了1ul质粒，所以载体，载体+目的片段可能都看不到。如果目的片段连接时串联的话，再稀释一下，琼脂糖的分辨率又不高，就都看不到了。" H8 Z: Q% w0 ?% }1 U1 p( u; ^' w
以上分析是基于你的电泳没有问题的情况下。

mckf111

2011-1-16 10:15 上传

下载附件 (82.37 KB)

: M" R& n" `9 B第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp8 g5 D0 K- B' X  s5 \7 d
第三泳道是质粒+288bp目的片段2 n9 e* o. n' |- M
第四泳道是质粒+570bp目的片段
) ]  Z% A! I0 ~/ l质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。
% q1 P& C* \! k  {# b: v. C5 U这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。
9 ?9 B! C0 G& m4 ~' c# n0 v0 XP.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。

mckf111

回复 ligangcw 的帖子' N; B# W' O9 I( n- N

2 N+ t+ ]! s+ S) c4 e+ U; Q不会太大跑不出来 我目的片段很小 就200多bp
6 G3 ~% E6 a1 q2 \重复了三次 还是这样 我等下传张图上来