关于提取蛋白的裂解时间问题~~在线等答案啊~~

小木梅

用RIPA加蛋白酶抑制剂提取细胞的总蛋白，目的是要做ICAM-1的WB。细胞裂解时间不同会不会有差异啊？平时都是裂解的30min，由于暂时用不了离心机，已经一个小时了……怎么办？先冻起来？还是先用个低速的把细胞碎片去掉，后面再高速离心？

ambassador

你要多久才能用上离心机，几个小时的话，就放到4°冰箱，应该没问题的（加了蛋白酶抑制剂吧~）。" s# _) @+ N" ~& b
这个和机械裂解不一样，机械裂解可能时间长了，把不该裂的裂解了。

白衣小彩

一直放冰上1到2小时应该没事，太长时间会影响蛋白量，主要怕降解

ngu3314

放冰上一两个小时应该还好，不过建议离心后把沈淀物也留下来，之后实验如果有任何问题还可以检验

kostarcell

楼上说的没错 沉淀物也别先着急扔掉 还有就是蛋白酶抑制剂一定要记得加

小木梅

回复 ambassador 的帖子& ]# ~, I7 W! o/ y1 T7 s. X

  L! i/ Y1 j' D7 }$ D; B+ J7 y, \相当感谢………后面用到了离心机了，一直在忙，等了一会儿忙去了，来不急上线看答案了，我记了裂解时间90min，要的ICAM-1在膜上，我主要怕平时30min并没有把膜上的所有ICAM-1都裂解下来，现在时间长了，怕裂解得更彻底对实验结果有误差。

小木梅

回复 kostarcell 的帖子) E1 Y! [# Q* b) m0 m1 C& t' _
9 w7 J0 Q- T; t- Y* E
恩恩，以后再出现这样的情况就不这么着急了……感谢

小木梅

回复 白衣小彩 的帖子4 Y; X3 ]- X8 U8 Z
0 A, Q2 _- A7 N9 R( b
恩，个半小时，加了蛋白酶抑制剂的，晚上测了浓度，与以往差不多，应该是没有降解。谢谢

小木梅

回复 ngu3314 的帖子0 \7 r: i/ e: g$ u

+ T0 Y# u+ m3 @. Q嗯，是个办法，感谢感谢

ambassador

小木梅 发表于 2011-1-15 23:40
$ ^# E- B+ {- L+ J$ k回复 白衣小彩 的帖子- w5 n' K5 ^: c: M8 b
0 ]7 V6 t& ^1 n
恩，个半小时，加了蛋白酶抑制剂的，晚上测了浓度，与以往差不多，应该是没有降解。 ...

1 R9 h* T) _3 I7 u  F* R你用的什么方法测浓度？BCA吗？我有个问题请教，用Nano-drop1000里的BCA模式测定的一些步骤问题。。