极少量细胞如何做荧光定量?

swxxx

要收集外周血的肿瘤细胞做realtime-pcr（相对定量），但流式分选的外周血中的肿瘤细胞太少，只有几百个，我打算比较3个样本9个基因的表达差异。打算用微量rna提取试剂盒去提取它，不知道rna的量够不够用，还需要去测od值吗？（9个基因+1个内参）x 3个样本 x 做3个副孔=90个孔，不知道在这个过程中需要注意些什么问题。

qingbao

极少量细胞是多少？提RNA的效率有多高？最后RNA量有多少？这些你心里有数吗？建议还是要定量。/ A* b0 G0 a* k. M9 ~$ _
另外，实时荧光定量PCR技术是为了有效地解决传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此在进行检测之前要先得到标准曲线吧，这个过程会耗掉你比较多的RNA量。还有，正因为realtime PCR比普通PCR精确，所以阴性对照呈现阳性的几率很大，要求操作必须严格且熟练。不是那么好做的，如果想做一次实验就能得到重复性很好的结果，估计概率比较小。事先打击你一下，有个心理准备。

深海寂寞鱼

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回复 swxxx 的帖子3 Z+ s6 d* }8 F/ w* s7 F2 g) l, k
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To SWXXX站友：
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! b7 o9 e1 Q& E3 O( d- v4 s     你一点都不要担心。其实这方面都已经有成品试剂盒销售了。3 P& U6 f% ^" A4 j/ r& H. n
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     你看一下TaKaRa的目录册就知道了。只需要几个细胞就可以用来进行real-time PCR.
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' u! W; b: _, ?     建议可能的话，把一本TaKaRa的目录手册放在床头，没事翻翻，不但能获得很多新的提示，而且对我们实验的一些细节设计也会有很大帮助的。（事先声明一下，我并非TaKaRa的拖）# I, E7 `7 U. Z$ I' e, B

6 W' n2 \; ~% x: \( V0 h9 g     我倒是担心你分选获得的细胞是否还是活细胞，能不能获得高质量的mRNA。0 Z+ o1 [, q8 B' l& k
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     另外，你也可以参考Michael F. Clarke小组2009年发表在Cell上的那篇miRNA-200c的文章。
9 B( X3 n- N) S+ X/ _他是把100个细胞直接分选到Tirzol里，然后用Real-time PCR检测miRNA的表达。虽然他们检测的是miRNA，但是其中的方法你是可以参考的。
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8 o( E" v4 `5 q! F+ d# H     当然这个实验的难度不会小。
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    如果你之前有丰富的RT-PCR或者Real-time PCR经验，那么对你来说摸索的时间不会太长。9 {1 T2 J( @9 v- i

3 ~, @# t; u7 l+ r' ~' ]" g1 p    但是，如果你是一个实验新手，或者有实验经验但是对于RT-PCR不能做的信手拈来。
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  c. [. \7 x' T8 c+ c) X) x    那么你可能需要一段时间对摸索。( G0 ]9 L& w* T2 d: |& u
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    当然啦，一切都是“小马过河”，只有你自己试了才知道。' Q) {4 Z' j5 n$ d; `3 s
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    祝你好运！

swxxx

太感谢了9 a: O3 }8 u( O; i7 v: R