极少量细胞如何做荧光定量?

swxxx

要收集外周血的肿瘤细胞做realtime-pcr（相对定量），但流式分选的外周血中的肿瘤细胞太少，只有几百个，我打算比较3个样本9个基因的表达差异。打算用微量rna提取试剂盒去提取它，不知道rna的量够不够用，还需要去测od值吗？（9个基因+1个内参）x 3个样本 x 做3个副孔=90个孔，不知道在这个过程中需要注意些什么问题。

qingbao

极少量细胞是多少？提RNA的效率有多高？最后RNA量有多少？这些你心里有数吗？建议还是要定量。5 y$ J: ]- b$ I( \
另外，实时荧光定量PCR技术是为了有效地解决传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此在进行检测之前要先得到标准曲线吧，这个过程会耗掉你比较多的RNA量。还有，正因为realtime PCR比普通PCR精确，所以阴性对照呈现阳性的几率很大，要求操作必须严格且熟练。不是那么好做的，如果想做一次实验就能得到重复性很好的结果，估计概率比较小。事先打击你一下，有个心理准备。

深海寂寞鱼

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, p  `6 X3 ?5 D3 _/ ~' E3 s! V回复 swxxx 的帖子
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3 m$ n3 O$ Y$ r/ X% }To SWXXX站友：
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     你一点都不要担心。其实这方面都已经有成品试剂盒销售了。
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0 L2 u. T3 {. s     你看一下TaKaRa的目录册就知道了。只需要几个细胞就可以用来进行real-time PCR.
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     建议可能的话，把一本TaKaRa的目录手册放在床头，没事翻翻，不但能获得很多新的提示，而且对我们实验的一些细节设计也会有很大帮助的。（事先声明一下，我并非TaKaRa的拖）( [" s+ L: w# v* A  |3 |

5 b9 X& ?$ d( R. B' B     我倒是担心你分选获得的细胞是否还是活细胞，能不能获得高质量的mRNA。5 Z. W2 N" o3 H/ S

0 |1 v1 M, H$ Y% L& @- R     另外，你也可以参考Michael F. Clarke小组2009年发表在Cell上的那篇miRNA-200c的文章。
) }% k& f1 x9 t- o2 |# T他是把100个细胞直接分选到Tirzol里，然后用Real-time PCR检测miRNA的表达。虽然他们检测的是miRNA，但是其中的方法你是可以参考的。
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     当然这个实验的难度不会小。& U6 z1 M8 F3 m

& e( g) ^0 ]8 A  d    如果你之前有丰富的RT-PCR或者Real-time PCR经验，那么对你来说摸索的时间不会太长。
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# N9 Z8 u( p# ]4 y. y9 j    但是，如果你是一个实验新手，或者有实验经验但是对于RT-PCR不能做的信手拈来。% I+ J. {/ M+ n# A+ L- [! X+ `
  
8 [' \6 {5 M+ L9 h    那么你可能需要一段时间对摸索。
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    当然啦，一切都是“小马过河”，只有你自己试了才知道。& j6 Z6 Q2 _8 Y
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    祝你好运！

swxxx

太感谢了
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