CSC冻存与复苏问题

amosummer

最近在培养CSC出现了一个问题。原代培养的细胞冻存后复苏发现细胞几乎都是漂浮的，类似死细胞。随后换过两次液还是这样。我用的冻存液是90%FCS+10%DMSO，在-80度直接保存。这种方法不知道是否科学，哪位高手能告诉我更好的保存方法？非常感谢！

eley

血清是FBS，你每次换液都离心了吗？还有为什么一直放在-80呢？放在-80多长时间了？

WAX

CSC冻存液不能含有FBS，不然肿瘤干细胞会分化的。2 j4 P' L1 W# g  R7 t
我看其他人有用含15%DMSO的无血清培养基作为冻存液，他们说-80℃冰箱可以存数周，一般是-80℃过夜后转液氮。

WAX

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# ^( B1 o; \/ k
. Y- ^0 Z7 l: X3 i- I冻存细胞不要直接到-80℃冰箱，最好4℃冰箱30min到1h。-20℃冰箱1到2h再转-80℃过夜，然后转液氮。

amosummer

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( q. p& M  j4 E- P
7 V9 L/ a. D9 ^# o3 U冻存原代细胞和细胞系一样需要有个温度梯度吗？

WAX

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' f" v- j. x4 u: v% ]  O  ~3 i
* ~% `. [& Q8 M% Q我没做过，从网上看到别人是这么做的。他们是从原代培养神经球。如有不对的地方还望指正！: n3 D- \1 o2 z& l# d  C3 X2 K
摘录如下：
/ \. @& j' m8 n+ L“神经球的冻存和复苏 ' m2 P- E( R5 n, _8 x3 d
1. 将含有神经球的培养液从24孔板移入15ml圆锥管。
9 x- s* y' I# S% ?6 C0 D2. 200g离心5min。
( }% X9 E- J, Q8 \/ w3. 弃上清，用10ml含15％DMSO的SFM（不含EGF 和FGF）重悬细胞。 8 ~( S2 `6 p! q0 e+ Q: w
4. 用移液管轻轻混匀，分装1.5ml每管（聚丙烯冷冻管）。
( a$ k2 q3 ]8 |. B9 r5. －80°C冰箱过夜。【译者加：我们通常在－20°C冻1－2h再转－80°C】
( t) p/ w1 g" c  r6. 次日晨转移至液氮罐保存。 ) L6 O' K( U% i% s/ c8 P
提示：如果不能使用液氮，神经球可以在－80°C保存几周。活神经球数量会随－80°C存放时间延长而减少。
/ G  N- V- U4 ^+ e9 v' a7. 准备复苏神经球，将冷冻管从液氮中取出，在超净台内回复至室温。 4 g! l" a% ]) n- z5 A
8. 将冷冻管内容物转入含有10ml SFM的15ml圆锥管中。 7 E, J* x" K' Q" u: ~
9. 200g离心5min，弃上清。
2 A2 U3 q# m6 t! K; ]10. 用4ml SFM轻轻混匀。 ) d2 h% l$ ^$ Z0 X+ X
11. 按每孔0.5ml种8个孔（24孔板）， 37°C 95% air 5% CO2条件下培养。 5 @( ?" _2 z+ u# E
提示：小神经球比大神经球（直径大于100um）更易复苏成活。在组织培养基中，神经球复苏成活率很低（小于20％）。建议每孔至少种50－100个神经球。通过提高冷冻神经球密度或在冷冻液中加入20％胎牛血清可提高复苏成活率。但要牢记胎牛血清可以诱导分化。 ”, j/ S+ A+ H! c( A

leisong12

学习了，谢谢分享，这都是宝贵的经验啊
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