请教mi-RNA茎环法设计引物

mckf111

回复 runsong 的帖子; b2 _: B/ ^* ?4 v5 X
( v2 T9 {0 G( x( O+ P. p! ^/ m" d
5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗
# j5 S, s+ x2 {9 U8 x; \( O引物序列是什么 还烦请指教

mckf111

回复 runsong 的帖子$ X; n* e5 E9 H) O3 ~. G, i' z
: u" t  \+ ~+ z' l  ~) @$ Y5 r3 `
应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
4 g" v! J: B4 e, z- I" l# r& |* @

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
9 M6 t$ u/ W& v) G是这样吗？+ J9 J$ k" x+ p( e& T/ g
所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。
) t9 e2 F9 d% G, x( K; c7 m, ~+ c; G, c6 R
sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

gunther

" b9 x( f9 }! V( M8 N# P
我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？
. S7 W6 I) `/ R6 J
2 ~% V$ g! r2 C. t" K$ s另外，为什么前面一定要多一段序列呢？' w  K0 [% C" `$ \

runsong

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% P/ V' w& o+ B* b8 O/ s* l
2 S8 w2 q# P; @我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
: E' _. h' Z2 w- O7 s5 L其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

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& [$ {9 u: G$ b; |3 F- n$ w
$ l- H( s6 I! x- Z6 }不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
1 _" u5 v" ]/ b7 w; N3 @$ X( n# W* l, hforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。% p5 _  L9 o1 Y( Y" c: v
这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。
/ w' I$ @( S6 Z7 C. b) r, `2 U) P) d8 i2 s
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

细胞海洋

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