请教mi-RNA茎环法设计引物

mckf111

回复 runsong 的帖子$ J7 }/ m. u! e# N& q
% h1 _1 ~( Y! E" n, _4 d3 o8 Z9 {
5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗
2 m0 q' u$ |3 T4 u3 a4 x引物序列是什么 还烦请指教

mckf111

回复 runsong 的帖子& A6 j3 R( Z' R* i2 `2 b6 V
. I4 s1 W1 \+ X2 j  y
应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。: H& X/ \7 _1 F5 h* ^: ~1 x9 C

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
1 N( a7 D* j5 U9 _5 H是这样吗？
* Y/ d: h; P6 m. W" o所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。5 O% H, {' t: R4 b
- f% Y0 H/ A" W  V- n3 t5 N
sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

gunther

' H! G5 F6 q! V
我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？5 s: m& r7 `8 a5 Y( _- a, L
+ E4 u0 l8 I7 S4 g9 ~( S
另外，为什么前面一定要多一段序列呢？7 F" u5 q2 ]+ N* j7 }" S3 E9 }

runsong

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$ I' P) L' R* a. G2 @3 L( E" Q! f/ h4 R8 M# J! L
我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。% j1 ^" J/ j$ N  H
其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

回复 gunther 的帖子8 N& |8 z1 y9 U

. Z# f$ l! s  g& o( \/ B2 B8 M3 s! D不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。( _! n; w. a$ L& C
forward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
  B* `, T) F& v" J( c* m; t这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。
2 {$ S1 o- L, Z- t/ Y4 G  e! K0 A
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

细胞海洋

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5 s& |, e, X8 N. V1 H5 t8 x) @- \: K! T! s
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