请教mi-RNA茎环法设计引物

mckf111

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" s. X4 Y2 }: W2 E% s& s6 \
$ Q8 \% ]# ?2 P3 }5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗1 N- S  ]  j, W
引物序列是什么 还烦请指教

mckf111

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  T, H. ~, N( P" E5 ]6 W. \- S1 P, d$ T7 h- L
应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。) d* X" p1 N# Z1 j) \) L+ L

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"" C& D+ y* N9 G
是这样吗？7 J9 v5 i1 W) G, N& K
所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。3 I! s- _, G  w7 W3 {7 O3 O
4 R5 v# O( ^1 m. w. a. Z
sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

gunther

0 H6 l3 S) y3 C8 o% R+ @7 w- }/ x我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？- e4 e; _8 S7 ?3 e5 F$ E/ m! q
. ~) a" I7 _7 Q* Y2 q  d9 X( P# I6 R
另外，为什么前面一定要多一段序列呢？$ {; W5 @+ j, L$ U) M  f6 a

runsong

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3 ~2 _- m" E7 Y+ B6 F! g% [- A2 ^* y" z4 G
我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。3 K, k* O" r. o) M& f- i% b
其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

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* G( A9 U  H. Q$ o1 }
! M0 r  L* P, A" U不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。6 M! l( n7 D+ z" d- x$ B
forward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。/ d" g2 \. A! Y, N
这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。2 }% J% B. F, E- ^; }% n
' H" Q- h5 M* _. i
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

细胞海洋

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+ _4 ?' c  t9 v" [3 k& i& ]/ |- L7 N$ X
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