请教mi-RNA茎环法设计引物

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。: z+ I. w7 ]4 p* p8 i+ L. L! N
版本一：查到以mir-145为例的帖子
% O( e( s) ?- y: `6 H3 A  K4 c              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。
$ g9 o0 w- N4 p% R: S              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。- E7 q9 U, n4 C) L' ^1 t! }0 z0 a$ s
        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG% J2 U- g( G- D) V
版本二：应用似乎更加广泛
9 A5 a/ b2 r6 W9 p( Q$ {              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。
7 T# M! Y0 B: v0 q" T
' P# v3 m  u6 ^( P, ^! G              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。4 ~$ A# y& x5 |/ a# S+ Q/ d' N
              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT" g' W7 p9 ]$ y; t+ g6 x
困惑ing...4 H: Y( p; L. V' F
8 L! D- D$ u* s
这两个系统原理一样，不知有何优劣。
& m$ l0 E$ K# d3 p+ C( y- ?+ `/ k) b2 y& O1 Y$ P0 Q

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。! g. Z# M7 V7 Z3 f
版本一：查到以mir-145为例的帖子
' K2 J: D2 D: |) g. o2 s              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。5 t: @8 z1 m0 \5 k$ f5 w
              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。
( |: F; u6 i; c1 r( V        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG
6 n- n& _5 `; ?! a1 T. B版本二：应用似乎更加广泛
% W! T! K" v; i# j              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。
- d" e9 v0 C3 @& J7 U; L! v              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。
/ k/ g6 u* N9 w: a9 \5 L) }; J              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT' Z& u* T" ~7 i
困惑ing...
- S; c8 S' K, V) r; B, T2 j. n' j% W. B* H
这两个系统原理一样，不知有何优劣。
! S0 C, Q3 z5 v
2 L3 N% d3 c& F7 e5 P* `7 M) Y

runsong

自己顶

runsong

悬赏没人要？！$ d, W9 |) J0 X. ?" W

runsong

回复 mckf111 的帖子
3 |: Z7 B0 ]) f# m1 r3 f* R  Q0 x2 I8 N
可以用5s，要是你还没解决的话我把序列发给你

runsong

回复 mckf111 的帖子
9 Y1 w0 _* B& n0 @0 X* b1 ~1 X" W" H0 m7 ?
第二种方法上游引物的通用序列是啥？

runsong

回复 gunther 的帖子
( ?; A  v7 p  A7 Z% v# W
1 U1 B+ n, H) o$ b$ B我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
0 e. ]$ Y6 X$ f' D4 N2 {' K) T其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

回复 gunther 的帖子) ?9 V9 t9 ~& R" L; Q
3 L/ r2 H5 M6 g4 R# }+ @
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
) k$ X" \& E: m, r% Pforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
3 h+ U  r8 C2 }  d* Q这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。; W2 W" |0 V$ u7 U6 u9 T+ J
% Q0 D2 k0 c0 \' O" M2 t% c
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。