请教mi-RNA茎环法设计引物

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。6 Y! \/ n3 h9 \. `
版本一：查到以mir-145为例的帖子
8 Y( ~8 ?! i: e1 v* \( ~              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。
" [4 }8 S" y6 T/ n              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。; y' M* G# b2 u$ H
        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG
7 n% y+ l; q) j+ O3 n版本二：应用似乎更加广泛8 W1 H9 t& o0 m; F, u+ t/ u/ n
              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。( c; S# l1 T# o7 z) s' v

# W0 i$ l: T0 J& }              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。
/ F9 ^& N9 }1 Y  G; _. q2 K& N! z- l) }              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT) m6 u3 U$ M; t; A$ W  M9 k5 h
困惑ing...$ L- c4 U- N4 a$ s, t; u: X8 h
/ W  s! i9 ~0 w) c9 i  `3 N
这两个系统原理一样，不知有何优劣。) C  _0 Q9 D! R. r  k

$ T, R9 ^0 n" L) s- T

gan107mz

学习了，多谢各位

细胞海洋

回复 foodmic 的帖子  Y4 |& D$ r; _) y; I/ G: w( k

% s! ^+ r$ X- a) f" B9 ~建议你发新帖提问

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

runsong

回复 gunther 的帖子' j, r* ?+ M2 W8 R& \
  i  k) A! P" X) r7 Z
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
6 t7 U( R( L2 N5 Y3 z% aforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
5 B9 r, i4 _1 I" k. b( K这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。( ^. E$ Q5 x8 \! I6 Z5 Y
) d. \0 s' ]5 u% y5 x8 r! D6 F
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

runsong

回复 gunther 的帖子3 z4 v* U, o1 Q' H9 k+ ]7 y

! b/ k, e; l3 M$ f& g2 z我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
2 W- l8 z' d, d# J其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

gunther

. V/ x2 M: j9 I; Y% Y: g
我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？
, l$ X, F$ G% n& R! B/ q) `
% ~; B% m; s1 P! `$ d5 j2 t8 U  ]另外，为什么前面一定要多一段序列呢？
, ~. J6 _* o0 Q: y$ a8 s

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
3 `4 d5 H* C9 H2 L* q+ |是这样吗？
. e0 x6 O, c* H! ~/ o3 n4 @所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。9 }, T3 n, M" R& g2 }

* e% y, K6 o& i  H3 H  }sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
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