请教mi-RNA茎环法设计引物

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。
' M: }* q) s9 W5 s版本一：查到以mir-145为例的帖子9 I4 E* N- S- T
              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。
* t8 F+ P: H! J6 F, \' M$ c1 J4 ?              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。" Z8 ~0 D: x! Y# m+ ~0 ?& S+ D
        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG
' ?- v! P- Q# r. n5 l7 H% r版本二：应用似乎更加广泛
6 X2 @$ ?. ^6 `5 |4 G              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。
5 k/ A% Q) a5 C, q( V0 x  K  A4 w& n6 c9 ^' [" \
              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。. ?1 `+ Q7 z3 \4 ?0 }
              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT
* M3 ]. Z/ Y. W; f) c( I" d& W1 G困惑ing..." @7 f4 z3 W' r% v

2 W, D2 _) N1 R5 a1 B, E" r这两个系统原理一样，不知有何优劣。. R+ P( s9 K# }- L! o5 k8 \
2 l; y1 \( L/ P

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。
9 `9 @; N2 @5 I6 @版本一：查到以mir-145为例的帖子; G9 ]9 n8 E9 ^" f% U
              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。8 h7 E3 w6 P) Y/ g& p: J: k
              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。
4 N$ t* z# G' ?) @        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG* d1 f/ \7 P6 Z/ S, u
版本二：应用似乎更加广泛
" P! u/ y' R8 t9 c8 U" r3 z# r              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。5 }8 z) z* {2 m; i
              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。6 q/ i% m" E6 N9 f+ T
              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT
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runsong

自己顶

runsong

悬赏没人要？！. O- O4 K3 _  g0 c: A; M

runsong

回复 mckf111 的帖子5 \8 ?3 z& R' s: U2 M: \$ n* p: a5 k
1 K% ~: I- F. x7 Y( P
可以用5s，要是你还没解决的话我把序列发给你

runsong

回复 mckf111 的帖子& ], {& ]1 r6 P, ~3 h
- g- s0 R: Q9 i4 @
第二种方法上游引物的通用序列是啥？

runsong

回复 gunther 的帖子
  J( M! R  ]5 g* Y5 ~( y5 t* T4 M5 z! j, `  U3 \; Z
我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
" g5 M! e6 m) j; t6 K7 U其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

回复 gunther 的帖子! x% {: d9 t0 W6 _8 k, }& f
* p. Q' }' {; L8 ]4 j. X$ x0 B- W) {
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
4 z" G4 a2 Z# ~forward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。+ P' z! W# m: P( b+ Q5 i
这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。  u; V  i- d, K

0 b3 S9 O/ [0 F9 p7 G0 N/ Z呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。