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在基因功能研究中,最有效的方法是阻止特定基因的功能,然后了解其后果。miRNA同样如此。. e" X6 B; a% Z( W
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然而,相比之下,miRNA的功能研究要困难得多。为什么?首先,miRNA没有蛋白产物,这使得研究复杂化。其次,miRNA的生物发生有多个步骤。最初的转录本为pri-miRNA,它在细胞核中加工形成前体pre-miRNA。这个茎环结构的RNA输出到细胞质,被Dicer酶进一步加工,最终形成了成熟的miRNA。成熟的miRNA没有poly(A)尾巴,因而检测起来要颇费一番心思。
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" `9 _* @# A; R! w j除了检测,miRNA的功能丧失(loss-of-function)研究也是难题。标准的RNAi技术行不通。成熟的miRNA与siRNA不相容,因为它们两者都能进入RISC复合物;pre-miRNA是茎环结构的,siRNA无从下手;pri-miRNA貌似是siRNA最容易靶定的,但一个是细胞核,一个在细胞质,好似牛郎织女,无法见面。/ K0 ^' D$ {- C4 `& K0 L9 j
1 V, ~3 K( C5 {( w7 x- |当然,科学家们也不是束手无策。miRNA不是能与互补的mRNA结合吗?他们就开发出与miRNA互补的寡核苷酸,作为mRNA结合的竞争性抑制剂。这些抑制剂实现了短期分析,在细胞培养物以及某些动物实验中都获得了成功。但是,如何实现miRNA的长期抑制?
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2007年,麻省理工大学的Phillip Sharp及他的同事利用相似的原理,开发出一种长期抑制miRNA基因的高效方法1。他们称之为miRNA海绵(miRNA sponge),意思是吸满了miRNA,这样它就无法与天然靶点结合。miRNA海绵是一条mRNA,其3’ 非翻译区(UTR)包含若干个miRNA靶定位点(如下图)。更重要的是,这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样,抑制剂mRNA就不会被降解,而与RISC稳定结合,让它远离天然的mRNA靶点。 |
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