DAPI和hoechst染色的区别

hndxws

最近想做个免疫荧光，在染核问题上有些疑问。DAPI染核和hoechst染核有什么区别，为什么有的人用DAPI，有的人用hoechst。个人觉得荧光的强弱和稳定性的要求不同可能导致选择不同的染色方法，不知这算不算是区别？还有没有其他的区别？

hualin840518

1、每个染料有自己独特的激发谱线和发射谱线.这也是以上两个染料的主要区别.
. @, M; I' x) D" V; r/ a另外Hoechest 33258 是膜透性的,因此在活细胞时候能轻松进入;DAPI是半透性的,有选择性的进入.
* g4 t' ?  a) O! E因此Hoechest 33258 一般用来染活细胞,可以长驱直入;DAPI一般是染固定细胞.( d9 f/ f9 q; Z: g
2、两者都可以用紫外看，参见以下的激发发射波长
  {5 W4 @4 [5 G( C$ l, PHoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。
8 A. s; l$ ~0 F3 gDAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。

hualin840518

回复 hualin840518 的帖子" ?1 c  h+ }# J: M6 X4 R

# X3 c/ v$ q( O' q- e0 @DAPI染色液
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# i5 U0 m+ B3 N5 V7 G1 D9 N# X6 \产品简介： 3 L6 R7 B# ?, R/ l  `4 t

& M( f. Q! k" [1 zØ DAPI染色液(DAPI Staining Solution)是经过精心优化几乎适用于所有常见细胞和组织细胞核染色的染色液。
+ [1 z! p+ Z0 R. F1 uØ DAPI，即2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，也称DAPI dihydrochloride，分子式为C16H15N5·2HCl，分子量为350.25，CAS Number 28718-90-3。 0 b+ V3 Z' f, x/ U
Ø DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
" o1 v, f$ A# S% NØ DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
+ A" V2 l9 \4 E. ~Ø DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。
, T2 J3 d' |* p) n( z9 WØ 本DAPI染色液可以直接用于固定细胞或组织的细胞核染色。
% A2 t  \3 U. [% d% H6 m6 h* P7 }! R

: [( \' w, |7 H3 ~保存条件：
9 y" z+ {7 {. W& B- L3 h& H. {: W  Y% S7 b0 K0 K
-20℃避光保存，一年有效。- H7 L' T- b* C5 h* x( ~8 L
" V6 l( T2 _& S
注意事项： # x1 U! [# \/ ~/ ~/ O5 T

$ d( n* b  t6 I' g8 T; N# SØ DAPI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。
3 U$ }; H! c' _. MØ 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。   T: ~  E, m- W- n4 v
Ø 为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。抗荧光淬灭封片液可以向碧云天订购。
5 J1 p* M4 |' p& l3 E: ^! }# G" v" P" F
* l2 J, ^' h% f, ^2 QØ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 0 M, k5 K7 O, ~/ o

) g: U* y" o) }使用说明：
' [! Q0 m  w9 c( k* R' T+ u" ]6 U1 {9 R
1. 对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行DAPI染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的DAPI染色。
9 L0 n0 j$ Q3 @9 x3 O2. 对于贴壁细胞或组织切片，加入少量DAPI染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。
1 H. c7 f0 I  p3. 室温放置3-5分钟。 % {& I4 u" O0 y" g
4. 吸除DAPI染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。 2 n# v% X! k1 G5 L. M9 O
5. 直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

hualin840518

回复 hualin840518 的帖子0 f4 t4 z2 R5 ?9 I/ s% w  B
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Hoechst 33342/PI双染色法
* z7 A4 C: o. Q  r8 ^2 K3 w( v/ _5 Y  E2 b
1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。* m4 J) b2 W! V: o% e& G* D) I
9 q6 c- q7 x: \) T" y2 G6 d
2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。% u( _; }% L. O+ a& a

1 T/ @: N- f+ p6 b* b3 |3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

have-a-rest

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wang_kai1212123

4 u) Y" m' Z+ Q" F; H7 _$ G* m
1 ]! z1 I. z3 o! A/ YDAPI 可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。# M- c. o  _: u& s/ i
Hoechst 33342、 DAPI染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光,同时，由于对细胞毒性小，hoechst可以用于干细胞（SPcell)的富集。不对之处，请多多指正~~谢谢/ u' O% d* Z  A- t! G

starlancer

回复 wang_kai1212123 的帖子- |0 Y( a) |. ]

  u* L1 |7 X! H6 Y别的都同意，但对活细胞无毒副作用有待斟酌，据我了解dapi是一种颇具毒性的东西，操作时尽量避免接触皮肤，所以对细胞应该还是有毒性的吧。

王乾

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低， Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。. j* B! }) G/ c1 s6 ]. g0 ~$ x/ t
DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。, y; Z) h' [' O1 ?+ i

hndxws

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% z7 }4 R5 X( U9 B4 q, q  ?" i8 w7 a: j5 M; P7 v0 |# L. w
细胞都死了，无所谓毒不毒吧

hndxws

回复 王乾 的帖子; _3 x" t; D* g, H1 r& Y
  D$ r. d5 o7 g$ W% K
那做共聚焦用hoechst好不好呢？还是DAPI比较好用啊？