关于脐带间充质干细胞培养

sunjianhua2000

近期做了几次脐带间充质干细胞培养，但效果不是很理想，所以想请有经验的大侠给与指导！
0 @% ?$ P5 ~  C9 A% ~具体操作方法( o) E6 B$ C$ x1 E+ q1 o
原代培养：组织块培养法。无菌条件转移脐带组织至操净台，剔除血管，将组织剪碎至1mm见方大小（未剔除外层羊膜层），15%fbs-dmem低糖培养液50ml混匀接种到培养瓶中，5天后补液20ml。培养至8天左右镜下可见细胞贴壁，15天左右见小克隆团，20天换液但发现细胞克隆团没有变大，细胞量增殖不明显，远远没有达到传代要求（感觉细胞像失去生长力了，而且形态也不好）。至今未查明原因。. c' }( m1 x* K! C3 c6 c( d8 ?* M
请大侠给与指导,请大侠给与指导！

Learner

你几天换一次液？是不是克隆团里的细胞发生接触抑制了？我也在做脐带间充质干细胞分离培养，上次用的是胶原酶消化法有污染没养成。下次我打算试消化法和直接贴壁法两种都试试。

get0715

我觉得最主要的原因是你原代培养的时间太长了，有14天就可以消化传代了，无论细胞有多少，毕竟刚贴壁的细胞成团的增殖，时间太长了就有接触抑制了，原代传的时候可以根据细胞量的多少一传一，或者一传二

呼吸

1、组织块法，建议你提取华通氏胶培养
2 n1 b6 t7 C% G8 _9 J; G. E/ X2、5天左右全量换液，10天左右半量换液，14天就可以长满瓶子的80-90%  即可传代% ?+ p! R' l" h# h& |" b
3、种瓶的时候培养液不要过多，T75的瓶子  10ML即可。

流云阿凯

我们实验室经常分离脐带间质干细胞！成功率还可以，方法可供参考：
% R: @& I7 ]7 T: G8 _8 p5 v1.把脐带剪成5cm长的片段，先在加入了1%的双抗的生理盐水中清洗血污
7 J6 P8 S9 p( C# g2.去掉脐带中的血管，把脐带的外膜去掉，只留沃顿胶的成分
2 P, h5 S" I; g8 J4 N7 }( m" a6 d1 C3.用剪刀把分离出的沃顿胶剪碎（尽可能把组织块剪小）
  i' f. x6 o8 ?9 G" K4.然后用DMEM：F12=1:1的培养基培养，加10%的血清。  h- H1 p8 e4 M
5.如果用100ml的培养瓶培养的话培养液的终体积为3ml即可，组织块的密度不要太高。( H* X, O" x+ n3 d5 x
6.首先要保证组织块能贴在培养瓶壁上，然后三天后换液，动作要轻柔不要把已经贴壁的组织块冲下，此时可适当多添加一些培养基。
) n4 T; B$ m! x% N& p/ _7 j7.根据我们实验室的经验，基本一周左右就有相当数量的细胞贴壁。可根据实际情况进行换液或者传代。9 s% u* y6 c# R0 C: Q- L
8.当然组织块也可以进行重复利用，再重复以上操作可继续培养出原代细胞。

sdwzg119

我们也用组织块法培养，基本每条脐带都能长出细胞，最长的养15天就能传代了，快的十几天就成了，你原代培养也长出来细胞了，15天就应该传代了，你感觉细胞少就传个小瓶嘛！不拖太长时间。还有细胞少的原因可能是你贴的组织块太多了，少弄点。

embryonic12

初代培养用35mm皿较好。可早些传代，不必等他长满。在这初代培养本来就不可能次次成功，需要运气

清影

回复 sunjianhua2000 的帖子" a2 F# N* y9 q) \$ F5 O+ \* B: l1 g

  j# m) i6 p3 X$ B7 ^- ]你加了50ml培养基，后期有补加20ml,你有多少胶质啊？组织块都飘起来了吧?还有就是细胞间的抑制作用，最好把外层的羊膜层剔除

yuyabinbin

回复 清影 的帖子6 a2 C1 Y  O7 d8 `; @  |" ~. C9 L

2 Q  l( I( h- F4 ?我问一下你们脐带这么容易拿到啊

gaorongbest

回复 流云阿凯 的帖子1 T9 w. V/ l: K; g, ^

  G- u. V2 a4 f+ }9 [1 `用组织块好培养还是用酶消化法好呢？如果是组织块培养，接种密度怎么把握才好，如果太密可能就长的细胞少了