电转染牛成纤维细胞的问题

wxl87

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' P6 s  m( J# Q9 q0 U+ M/ R( |# c( b: ^: b  w' g- T
你的附件下载不了，解决一下

wxl87

质粒DNA最好要线性化，而且在电击以后，用自带的吸管吸出细胞，不要用枪头$ y( x" H$ j) s" v
而且看看你的荧光镜有没有问题

zpzp0312

质粒需要线性化+ X2 A3 L! m2 G3 F
细胞需要单细胞悬浮
4 g* _, ^" Q! {介质建议使用商品
& T% x9 ?: d' l$ w+ J1 N4 x' D& N但DMEDM和PBS也可以使用，没很大区别! m! A6 d$ D  T3 C4 p( C
另外50%死亡也不是必须的，死亡率也不是评估电转正常的关键指标啊，没必要看中这点

xiangchou812

不知道你的质粒中的Red2有没有活性?建议先转染一下293细胞看看有没有活性.祝好运!

miRNA

稍等一下，我把所有的buffer都整理一下，发出来....

miRNA

Hank’s buffer：% r  |; [! c2 [4 \; o! S% T  U

( {- g# M; i  L# A6 J/ R: ^% m137 mM NaCl; % x4 g( \- _3 a( ?* T. \6 p
5.4 mM KCl; # |6 g8 i0 p  o+ w& b' {7 Q6 K
0.95 mM CaCl2; ( H( ?, v: X! o5 a
0.41 mM MgSO4; 7 {% Q) }) S; c5 U
0.49 mM MgCl2; # Z- o2 i9 }6 j# Y& W1 g, x
4.17 mM NaHCO3; ; {. f( ^" p# t! i0 I8 W
0.34 mM Na2HPO4; 9 s* X, y* q; P  l0 E- Y
0.44 mM KH2PO4;  
6 e& {* ~5 {% g7 M20 mM HEPES, pH 7.2
6 H  V; e: p  i2 P0 k! d
2 f7 [. y, l$ {7 E$ F- k可以直接购买来自HyClone Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)。2 L. N3 H; a! V& m; Z
来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

Berg’s buffer
: s, Q2 F4 k$ F9 R
* W) ^) l2 C# s3 s! P5 k. X& ~
9 n$ V! F- t" T  `6 C! K1 J" E名称        需要量        分子量        配制100ml所需  a' k+ }$ o; V( O3 g4 p7 g  g
NaCl        137 mM        58.44        0.8g* K2 V/ t' j- t: K
KCl        5 mM        74.55        0.037g) }- [; ^7 u! @+ j! H( @3 i
Na2HPO4  (-12H2O)        0.7 mM        358.14        0.025g, n$ x% \+ O" f. o, L! L
HEPES    (pH 7.05)        20 mM          238.30        0.4766g4 V1 u# i2 `8 ?* z; h2 S: t1 g
dextrose        6 mM        198.17        0.118902g8 k( h8 S, j( k' N# D5 F- T
) j1 v: {& k& `( N7 c2 [' ]: L
同样来自文章---Efficient expression of foreign genes in CHO DHFR(-) cells by electroporation

miRNA

还有Cytomix buffer,文章里面有，就不列出来了...

miRNA

Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts
3 |! n5 r) ?, f7 r这篇文章里面用的是混合配方:
  x. G. E( Z  J% d  n. ]/ |# |Cells were resuspended in transfection media (75% cytosalts [120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4; pH 7.6, 5 mM MgCl2] (van den Hoff et al.1992) and 25% Opti-MEM)
5 U9 C5 T, I% n0 Z4 \# j. k" J' l8 ?# E4 X6 c( G- _

miRNA

我自己试过1640，DMEM，Hanks' buffer，
: }! }$ Z) @) E4 Z8 n! {说实话，别浪费时间摸条件了，从公司买现成的电转buffer吧...
, Z: m% l! ]- Q/ H4 n不过个人很看好最后一个混合配方，我自己没有试过，
0 N( P  y: q% v0 r用各种盐成分配置成的Hanks' buffer和DMEM等相比，感觉有明显的不同，5 X- ^0 A7 D& _, U- j( N! V7 x
因为都是离子成分，应该是电阻很小，电流很大，所需要的条件和DMEM相比应该不一样，8 P4 X5 s: Z7 J+ d
所以混合两者成分，应该是好一些...否则只用DMEM会比较钝(？个人理解)...
3 F% H0 V) A* P5 A* v2 G# ?8 ]0 ]6 n; O$ v5 W: T) I- M8 C
同时质粒的纯度要很高，如果你只测260/280或260/230是不可能看出来质粒的纯度的...4 D6 t) l; G6 S$ e2 ^( Z
高纯度的质粒转染效率会明显(?也许只是稍微)高于低纯度的质粒...! B* g3 C( T( U+ T. e

+ o9 I+ x; j2 h$ D希望idealgas会很快做出来...% j- a# M: M5 z7 e/ ]
谢谢您的回信！在此回复，以示感谢！' t. v# G- X. n+ V  f5 Y