小鼠脂肪干细胞传代后老化，原因？？？

zerollx

     最近一直在做小鼠脂肪干细胞的分离提取与培养，用的是6周龄的ICR雌鼠。步骤如下：
1 ]$ t, S, f* p     1、取腹股沟处脂肪组织，尽量去除可见的血管，用含300u青霉素、300ug硫酸链霉素双抗的DPBS洗涤3~4遍。
6 h! f" z! L5 @, V- }    2，充分剪碎，用0.1%的一型胶原酶37度振荡消化1h。% X' Q, f7 a; e1 [$ [! F
    3、10%FBS的DMEM培养基灭活胶原酶，200目尼龙纱布过筛。1 \% L; U+ a" {$ \0 F( ]
    4、10%FBS的DMEM培养基洗涤3~4遍，含双抗，10%FBS、DMEM/F12培养基培养（0.5ml脂肪组织分离出的脂肪细胞置于一个35mm皿和60mm均做过），24h后换液。
1 I( h( A: }. V  ~/ x   5、每周换液2~3次，一般一周后长满，80%~90满时胰酶消化3~5min，1:2传代。/ p% q) L) N8 e& N; f2 z
  原代时的状态很好，但是传一代后细胞就老化了，不知道大家有没有遇到这种情况，又是怎么解决的，诚请指点……

dc1055

你传一代后是凭什么判定细胞就老化了？

616933964

是不是你传代是胰酶消化的时间太长了呢？胰酶对脂肪干细胞是有损伤作用的，我做的是猪的脂肪干细胞，消化的时间最多就三分钟就终止了，不知道小鼠的是不是有不同。

wnavy200299

首先解决的问题不是老化问题，我觉得首先解决的问题是：分离出来的细胞是脂肪干细胞吗??你做鉴定了吗，不用急着去传代什么的！！

zerollx

回复 dc1055 的帖子
; ?# o1 }& o5 l: P* C- Q, A
% ~! \8 s0 J3 b# T( r( e1:2传代后4天细胞都没有见到明显的增殖，而且死亡细胞数目逐渐增加，细胞间颗粒物质、碎屑增多，细胞边缘也粗糙了……

zerollx

回复 wnavy200299 的帖子6 C. Q2 V0 K# P1 p$ t

' R5 T8 |- X& N' ~' C鉴定细胞是否为ADSC，常常需要将其传到第三代再做进一步分析……

冠忠

师兄，我十分了解脂肪干细胞在培养过程中容易老化的问题。基本上，如果用传统培养液培养（FBS+DMEM)，很大机会在P1的时候已经生长缓慢，甚至已经老化。我用了一年时候去了解和研究，发现用一定分量的生长因子和维他命可以防止脂肪干细胞老化和维持其原始性。现在我培养的脂肪干细胞可以传代到P20都没有问题。

zerollx

你真有毅力啊！能否留下QQ或手机号，咱具体聊……

zerollx

回复 冠忠 的帖子
1 e0 w3 f' ?7 t- J# H3 E& G; J- l* ?9 Y1 C: @
能不能请问一下你加的是什么生长因子？

fzw4ever

回复 冠忠 的帖子4 e0 l* ~) i" P& S+ a
% N" e0 v4 w  J* ?
你真厉害，能不能告诉我您具体加的生长因子和维他命是什么？量是多少那？