怎么克隆基因的启动子？直接用基因组DNA吗？求详解

hndxws

如题所示

zhangyan813

这要看你打算克隆什么启动子，该启动子在NCBI上可以查到序列吗？# p& v3 H" W. n0 E6 N) o' l
1. 如果该启动子已经有人克隆出来，并且在网上可以下载到。那么根据已知序列设计引物，直接从基因组DNA中进行PCR克隆就可以了。* j% h7 x5 A) s2 H* a2 J7 F7 B
2. 如果该启动子目前还没有人克隆出来，那就先在NCBI上找其他物种该启动子序列，软件分析保守区序列，在该序列中设计引物，基因组DNA进行PCR克隆。

wnavy200299

克隆某个基因的启动子，一般是该基因上游1~3kb，然后查看一下特殊结构，比如在真核生物的-30区得TATA 盒，-75区的CAAT盒，-90区的GC盒，以及+1位的A TG 等等。另外还有生物信息预测之类的网站可以预测某一个序列是否是启动子序列，如：http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/8 ~) C( T5 Z7 {) F
http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm4 |9 q- o4 V- d. w5 c; o0 B+ D% o0 i
http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
& \9 o% U5 s: v+ g* ^/ ghttp://tools.igsp.duke.edu/generegulation/McPromoter// c  E# j2 E: R; B. W3 Y5 ~( X
一般这些网站提供的数据还是很可信的！！ok！！Good Luck！！

hndxws

我没做过，我是怕会不会克隆不出来，因为我觉得基因组很大，就那么一段，不会很容易吧。因为我们克隆基因时，经常是从cDNA里克隆，cDNA里的基因拷贝数应该比基因组里多，有时就很难，所以我觉得克隆启动子会不会更难？
1 P9 m6 I1 S# `' p4 D9 g' d; J4 ~

wnavy200299

回复 hndxws 的帖子+ o7 B/ w& b+ R- I# g* u7 a
2 I) J! \, [) s) k. y8 S+ @
很好克隆的！你要相信PCR哦，更要相信你自己哦~
" o/ w0 e8 E# Q  B" Z1 v. F对了，设计引物的时候，你可以设计两套引物（嵌套PCR、或者叫巢式PCR）,就是在你克隆的启动子序列外侧设计一对引物进行扩增，然后用他的扩增产物当模板，用内测引物在扩增一次，电泳看结果。具体的原理什么的你可以参见网上信息，这方面知识很多。/ @4 n! U. w" z

王乾

基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没有确定其转录起始位点的时候，假定NCBI上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游2000bp左右和下游200bp左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的.  Y; c9 }4 |, t2 E
当找到这个比较核心的启动子序列后，可以通过一些在线的软件去预测其顺式作用元件的位点,,每个在线软件都有自己独特的算法分析,得到的结果并不都是可靠的,每个软件都有自己的优势，需要多综合一些软件预测的结果,并通过分析预测出来的转录因子是不是和该基因有功能上的联系等做进一步的选择，继续做下面的验证实验。7 q+ A) m! c6 F$ U  w9 ]
1.EMSA  反式作用因子一般指的就是转录因子,顺式作用元件一般是指转录因子和启动子结合的那部分序列,一般是10-20bp左右.4 V: |  W" L0 A" `: }# q
点突变证实该顺式作用元件对于启动子活性是有影响的,接下来就要用EMSA实验验证反式作用因子和该顺式作用元件在体外是有直接结合的.,反式作用因子可以用细胞核抽提物做，也可以用体外表达纯化的蛋白，也可以用该反式作用因子的抗体做Super shift 实验，进一步证实该证顺式作用元件同反式作用因子的特异性结合。
' J2 P* o8 W) |, ?  {: T2.CHIP   当EMSA实验得到阳性结果后,还是不能最后肯定该反式作用因子和该顺式作用元件有结合.毕竟体外的结合并不能代表生理条件下的结合.接下来就要用染色质免疫沉淀(ChIP) 技术来证实在体内的生理条件下该顺式作用元件和该反式作用因子是有结合的.