关于mESC传代密度与其细胞状态维持的问题

dilal

ESC传代密度让人很纠结，养了半年细胞了也不是很清楚。师兄告诉我ESC可以传的稀一点，因为ESC自我增殖能力很强，单个细胞可以长成一个集落。从来没有细胞计数过，显微镜下目测低倍镜视野下有4-5个细胞即可。照着师兄的方法去做，但发现细胞长得很慢，一般要6-7天才可以传代一次。查阅了ESC培养的相关protocol，发现大多数认为传代比例不能大于1:10，3天左右传代一次。而师兄的方法传代比例远远大于1:10了（离心后的细胞稀释成2ml后往往只加上一滴 ）。师兄认为细胞长得慢不是传代密度小的原因，是因为血清浓度低（13%）（师兄不认为传代比例过大）。
% Z, e, A4 i+ F! C查阅了许多protocol，没有明确的说明传代后的接种密度，让我有点迷茫了。不知道是师兄的方法对呢，还是protocol不权威。询问几个相关问题：
4 T/ j+ Y$ L% G- q! O% l1、mESC习性如何？是喜欢独处，还是不喜独处（喜密还是稀）？
* ?9 o  d& e& f+ h: `( C2、mESC传代密度对其自我增殖及多能性维持有啥影响？合适的传代密度是多少？
! N% q4 r4 N/ q/ Q3、mESC培养过程中如果出现分化的细胞集落，该如何处理？多次传达是否可以去除分化的细胞？$ \5 k9 \* j( c( e% _* `
4、传代消化时挑选状态好的单一集落进行传代接种，是否可以保证传代后细胞处于未分化状态？- d% @* g6 z' |, R# |3 l# A
希望师兄、师姐多多指点，若能上传手头权威的protocol，将不甚感激！$ r1 i7 O, U2 P* t/ c, g
2 |1 `; D- C2 W0 T* ]& z
我先上传一个我手头的protocol
( G, x- i0 Z9 S; _% G

懵懂干细胞

我没有严格计算比例，大概应该在1：5、6吧，也就3天左右传代一次啊，6、7天的话我觉得是有点长，4 n: n1 s  G' B
ES细胞培养过程中除了lif抑制其分化外还有就是细胞密度低一点也有效的抑制细胞分化，ES细胞克隆间的相互接触
, y' _# `% m$ v9 _作用也能促进细胞分化！所以传代还是稀一点好！

懵懂干细胞

& E) c. s# l+ c  W! U这是我最早看到的中文文献！

conggu

谢谢楼主，我也想问这个问题好久了。。。

almasun97184

7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。, k9 R, A7 l' J3 s, `, p; W+ z
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状态挺好的，基本没有分化。
  @' \+ L  P* s- T: {6 n1 ~. E  E3 x7 q如果分化细胞多，最好挑选好的集落传代，或者减少消化时间。ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点。
0 G; X  ?7 T0 u# L* t4 _, I$ K' `血清浓度一般都是20%。
1 a6 o3 q( J) G& @  |* l为什么你不按照标准操作规程，而要用不被广泛承认的操作方法？到时候写文章都不好写呀，后续试验的结果也不可信。

almasun97184

7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。
) M  g) U( i# p- a/ w我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状态挺好的，基本没有分化。
. {) c% r. s7 j$ Q如果分化细胞多，最好挑选好的集落传代，或者减少消化时间。ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点。
) s  h5 Q% M$ T血清浓度一般都是20%。- ^4 _5 k+ E! q/ ^- m0 n$ m
为什么你不按照标准操作规程，而要用不被广泛承认的操作方法？到时候写文章都不好写呀，后续试验的结果也不可信。

dilal

回复 almasun97184 的帖子) U1 x5 r2 A/ n- ~- [) d

& Y+ |+ J+ u- W! Q谢谢你的回复，未分化的细胞容易消化而分化的细胞不容易消化。请问一下你是在哪里看到这样的描述的，我一直在查找这个问题，都没有找到答案，而师兄跟我说的恰恰和你的相反。% W* _" @9 y  R* K+ P4 B
忘了说明了，我们采用的是无feeder的培养方法.

7ubo

dilal 发表于 2011-5-7 10:59 3 ?7 Q0 F+ c# C! n4 {( W
回复 almasun97184 的帖子
3 y' W- h* p1 P, q+ b9 S4 {  ~
2 D2 G7 v8 j8 o谢谢你的回复，未分化的细胞容易消化而分化的细胞不容易消化。请问一下你是在哪 ...

8 Y( n4 V2 Y4 }% m; j4 f* T/ Z
无feeder的培养， 需要什么特殊处理？什么种类的干细胞都可以这么养吗？有什么弊端吗？

7ubo

almasun97184 发表于 2011-5-6 15:34
* B5 S% |2 c0 r7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。  o; u7 j) V8 t
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状 ...

/ @* t8 q- R- F
“ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点”6 r" w( M: ]- u7 i
消化之后可以用枪吹吗？

7ubo

ESC的克隆之间接触为什么会造成分化呢？必然造成分化吗？有没有这方面的理论研究？