请教一下，大家做转基因的怎么来挑取克隆细胞？

绿雪

个人建议用96孔板，虽然看细胞、给细胞换液什么的非常麻烦，但是对于筛克隆还是比用大皿容易些，细胞没那么容易老化死掉，特别是对于转染效率低的实验相对有效些。用枪头自作克隆环我也尝试过，但是环固定不了，加液的时候容易移动。另外一个问题是加的胰酶基本都集中在环和皿底接触的位置，中间的细胞消化不到，如果要使中间的细胞消化下来，胰酶用量就必须比较大。/ n4 E8 \% i1 W
个人实验过程中的一些心得体会，体细胞转基因的稳定筛选确实是很头疼的问题，不知大家有什么更好的方法没有？

生物化学zy

回复 xiangchou812 的帖子4 t& D" N! k2 G, f; T) @
" V6 f7 m9 j. C/ C* s$ a5 _
就是像葡萄糖口服液那么大的瓶,医院应该有很多,那瓶不是圆柱型嘛.到脖颈那个地方就细一点,这样说吧,瓶口为a,瓶颈为b,瓶身为c,去掉c,保留a与b,就是尽量保留b,因为到时候那个留下的瓶颈的高度会影响你加胰酶的体积,
" O- F8 Z; X3 M* U具体做法:将这个瓶用纱布完全包上,左手捏住瓶口部位,用钳子在瓶颈稍微向下一点,使劲一敲.就会将瓶子的身子去掉.注意小心玻璃渣.完事后可以把不平的地方用砂轮磨一下就行.

生物化学zy

回复 xiangchou812 的帖子: T% F2 P$ f# T2 \, t

( v- d$ M6 `- f就是像葡萄糖口服液那么大的瓶,医院应该有很多,那瓶不是圆柱型嘛.到脖颈那个地方就细一点,这样说吧,瓶口为a,瓶颈为b,瓶身为c,去掉c,保留a与b,就是尽量保留b,因为到时候那个留下的瓶颈的高度会影响你加胰酶的体积,
! Z! k- Z. N( }+ h( D0 C& q6 p具体做法:将这个瓶用纱布完全包上,左手捏住瓶口部位,用钳子在瓶颈稍微向下一点,使劲一敲.就会将瓶子的身子去掉.注意小心玻璃渣.完事后可以把不平的地方用砂轮磨一下就行.

wnavy200299

深海寂寞鱼 发表于 2011-5-17 09:40
6 \4 ~: E$ {& V$ G回复 生物化学zy 的帖子
* A  N# i3 ?2 p7 e# C( {8 W9 b: w, w3 Q. u: q' C- R' k/ ~
  to 生物化学zy：

7 a# [* a" X: b4 l8 S2 k3 \关于克隆环，说了半天，还是整张图片看看，比较直观。9 F. Y8 b( C% K- U* m# Z5 [/ t; [
/ l( b# a: [( [& w$ `0 Z

) V# |0 x$ B& i; s; u( ^# A8 Z1 C9 f; Q
至于挑克隆的方法，生物化学zy 已经说过了，
3 `8 u3 \8 A/ A9 J在此就不诉说了。但要注意消化时间，长了克隆就有可能养不起来。/ ]1 R2 N# r+ m' x. Q: h' \
前两天刚挑了几个克隆细胞，感觉有几个不太好。
; Z! Q. v0 I! u( C. w再就是老生常谈的问题：注意污染！！！！
" \" y/ ~9 |3 F  G
/ B( H8 G9 L' A% xok！
1 E% Y; R8 f- u  X/ U+ C

wnavy200299

更正“长了克隆就有可能养不起来。”5 P  [# h/ h1 v3 n7 h  H: k7 N
挑了的克隆就有可能养不起来。”
) k& P4 x8 [! O& c5 h0 D8 @
. K5 V" Q5 B( v. P# l

xiangchou812

回复 wnavy200299 的帖子
8 u4 Q9 c; u! T6 q: |/ r" ^5 i8 R9 B
非常感谢。这下一目了然。图片还是比文字明了啊。- a2 y3 e" V% i  T
不过这种方法好像只有在克隆少的时候管用吧？不过确实是个非常好的方法。
7 O+ Y' U) q- i" E学习了。

xiangchou812

回复 绿雪 的帖子
9 H6 j  X& d+ e; n2 p$ F' X
& k& ^8 A, ?8 K* Z: o7 h( F' S2 X准确点说应该是打靶的难筛，随机整合的细胞还是相对容易很多的。  s# r3 n, @/ b0 a
就用96孔板，一次转上两三皿细胞，做上两次应该就能筛得到的。

sheepthief

回复 生物化学zy 的帖子1 M7 X/ j2 c0 B2 O% F9 f

' J# @: q  U9 p) n- k8 l' p7 W& l# K. a高明

yiyeqiu

我们实验室的做法是用6孔板加药物筛选，当形成稳定的克隆后，用1ml的移液枪头比较大的那一段做成环，加胰酶消化，操作和楼上的差不多了。

wnavy200299

不管用什么克隆环（玻璃瓶口环、大枪头粗短截断部分等），基本意思和思想是一致的。
/ [( e( V+ `3 d8 H* h1 }转染一般用6cm板，转然后（12h后）分板，一般分板比例为1:10~12（1个6cm板分到10~12个6孔板），分板时不加药，次日换液开始加筛选培养液。一般10天左右出现克隆。挑克隆至24孔板培养。ok~