求助干细胞的流式检测

蛮蛮1984

本人做脂肪干细胞的流式检测，选用的是CD44和CD29，但是做了三次基本都没有表达，不知道是什么原因呢。我的细胞是送到别的单位检测的，他们做临床检测多，没有做过干细胞，不知道是不是条件不对呢。有高手做过干细胞的流式检测么，能告诉我染色的注意事项和protocol么？急啊，请各位帮帮忙吧。

a86856635

用甲醛固定了吗

蛮蛮1984

回复 a86856635 的帖子
' k! \3 o& l" K5 H' a0 i8 I0 J; w% t! M. M3 K$ o
没有，因为我们送过去最多也就1个小时时间，所以是消化下来后，用PBS洗了，然后用PBS悬浮送过去之后才染色上机的

sdjjfangfang

孵育抗体的条件呢？一般会选择在4度40分组或者是常温半小时。0 p8 w+ v+ g: A! j4 j9 ^$ I
还有你的抗体是直标的还是间标的？如果是间标的，二抗选择的没有问题吧？* H0 E6 n) Y$ K+ L# q  k0 p# _
在做检测时，有对照组吗？

pauldong

这个抗体单标就可以了啊，没有表达的情况很奇怪，是不是标记过程有错误

aminhair

第一、检测抗原抗体反应时要充分了解抗原的特性。现在组织或者细胞中鉴定，然后再上流式。/ f2 z# u: U! S" H7 `' K
第二、固定液对抗原的影响很大，要选择适当的固定剂。长时间时最好固定，防止抗原的变性。
: s# n' q4 |% r6 _/ @! q第三、操作的问题！一定要保证低温，尤其不固定的时候。
6 X9 ~9 w( [6 @1 Z$ U第四、标记完事了可以上荧光显微镜检测，知道有无荧光才进一步上机器。否则盲目实验是浪费东东的。
# U7 t4 k% c9 G' E9 K# j第五、统计的细胞数目一定要达到标准，10000以上。
0 |+ L& Y) @& y: g6 G第六、充分了解机器的特性。你的标记能否被仪器上的激发光源激发？是不是在探测器狭窄的检测波段里呢？仪器的参数要需要经验丰 富的技术员来实验。
* j" F! c0 s0 b0 a$ [" k第七、双标记的细胞，对照组一定要做好。否则很难判断阳性与否。
1 a5 X, S' c4 t* s+ d! `' T第八、做实验要心平气和！尤其请人做。要知道没有一个实验是一次能够完美成功的。所以一定要有耐心。5 R  Z  V9 T7 s& J, S- M- k7 W- y
祝你的实验顺利！要包包和威望哦！谢谢！

a86856635

那你的散点图怎么样，细胞碎片多吗。毕竟pbs里没什么营养成分。
' a/ Y/ o- I# d* \$ G, o: t下次把细胞一起带过去再处理试试把

a86856635

对了，你们是用胰酶消化的吧。有可能是胰酶把蛋白水解了一部分。用细胞刮刮下来再试一次吧

chaoruihua

回复 a86856635 的帖子
6 Y& h. L5 s2 a0 ?5 W; _! t
" c" m+ x7 k7 i/ t  F如果是用胰酶消化的，建议你将细胞放在培养基中，在细胞培养箱内回复一小时后再染色，因为有些抗原对胰酶敏感