求助干细胞的流式检测

蛮蛮1984

本人做脂肪干细胞的流式检测，选用的是CD44和CD29，但是做了三次基本都没有表达，不知道是什么原因呢。我的细胞是送到别的单位检测的，他们做临床检测多，没有做过干细胞，不知道是不是条件不对呢。有高手做过干细胞的流式检测么，能告诉我染色的注意事项和protocol么？急啊，请各位帮帮忙吧。

a86856635

用甲醛固定了吗

蛮蛮1984

回复 a86856635 的帖子7 s. Y% U, C6 V' W4 q- Z) C

8 ?6 M9 n1 q4 \. F7 E4 `0 A没有，因为我们送过去最多也就1个小时时间，所以是消化下来后，用PBS洗了，然后用PBS悬浮送过去之后才染色上机的

sdjjfangfang

孵育抗体的条件呢？一般会选择在4度40分组或者是常温半小时。
* z4 `! Y5 o  r7 ~还有你的抗体是直标的还是间标的？如果是间标的，二抗选择的没有问题吧？
6 h) Q$ A; ?6 ^; U4 w在做检测时，有对照组吗？

pauldong

这个抗体单标就可以了啊，没有表达的情况很奇怪，是不是标记过程有错误

aminhair

第一、检测抗原抗体反应时要充分了解抗原的特性。现在组织或者细胞中鉴定，然后再上流式。* R# [- O  X* ?2 w
第二、固定液对抗原的影响很大，要选择适当的固定剂。长时间时最好固定，防止抗原的变性。9 E! }# k9 Q! w$ B/ N: W4 z
第三、操作的问题！一定要保证低温，尤其不固定的时候。4 |1 F7 S! x$ C7 i5 ~. g
第四、标记完事了可以上荧光显微镜检测，知道有无荧光才进一步上机器。否则盲目实验是浪费东东的。( v% L' ?) `% z8 k4 z
第五、统计的细胞数目一定要达到标准，10000以上。" X# O6 \; ]- g7 H( I% z
第六、充分了解机器的特性。你的标记能否被仪器上的激发光源激发？是不是在探测器狭窄的检测波段里呢？仪器的参数要需要经验丰 富的技术员来实验。1 S# z5 Y- s. A9 o
第七、双标记的细胞，对照组一定要做好。否则很难判断阳性与否。
- n0 a/ |5 k8 s; G' U第八、做实验要心平气和！尤其请人做。要知道没有一个实验是一次能够完美成功的。所以一定要有耐心。
& D3 q4 J2 j" W( U9 E' w/ L祝你的实验顺利！要包包和威望哦！谢谢！

a86856635

那你的散点图怎么样，细胞碎片多吗。毕竟pbs里没什么营养成分。
& R: L0 h, V9 _6 p下次把细胞一起带过去再处理试试把

a86856635

对了，你们是用胰酶消化的吧。有可能是胰酶把蛋白水解了一部分。用细胞刮刮下来再试一次吧

chaoruihua

回复 a86856635 的帖子4 d* E" O# a4 f# i& j2 c
) Q( |6 W1 m  D& T2 @
如果是用胰酶消化的，建议你将细胞放在培养基中，在细胞培养箱内回复一小时后再染色，因为有些抗原对胰酶敏感