求助干细胞的流式检测

蛮蛮1984

本人做脂肪干细胞的流式检测，选用的是CD44和CD29，但是做了三次基本都没有表达，不知道是什么原因呢。我的细胞是送到别的单位检测的，他们做临床检测多，没有做过干细胞，不知道是不是条件不对呢。有高手做过干细胞的流式检测么，能告诉我染色的注意事项和protocol么？急啊，请各位帮帮忙吧。

a86856635

用甲醛固定了吗

蛮蛮1984

回复 a86856635 的帖子3 o: B+ h' f) [" J/ J8 @" F$ d  O" Z3 D
( m) G$ P- b- u4 [& v
没有，因为我们送过去最多也就1个小时时间，所以是消化下来后，用PBS洗了，然后用PBS悬浮送过去之后才染色上机的

sdjjfangfang

孵育抗体的条件呢？一般会选择在4度40分组或者是常温半小时。
" m) q# |4 q) E3 _2 H2 R1 o/ r3 O还有你的抗体是直标的还是间标的？如果是间标的，二抗选择的没有问题吧？
5 ?% z3 M) C# Y: G! K在做检测时，有对照组吗？

pauldong

这个抗体单标就可以了啊，没有表达的情况很奇怪，是不是标记过程有错误

aminhair

第一、检测抗原抗体反应时要充分了解抗原的特性。现在组织或者细胞中鉴定，然后再上流式。) t2 b( D3 S, a# C, d
第二、固定液对抗原的影响很大，要选择适当的固定剂。长时间时最好固定，防止抗原的变性。. _1 K+ S% p( w
第三、操作的问题！一定要保证低温，尤其不固定的时候。
- v; Q+ U3 {* z& p& T" z第四、标记完事了可以上荧光显微镜检测，知道有无荧光才进一步上机器。否则盲目实验是浪费东东的。& f2 ~  i5 w: M  e; F' U, h
第五、统计的细胞数目一定要达到标准，10000以上。; s* H- L3 \  ]9 D% {, F
第六、充分了解机器的特性。你的标记能否被仪器上的激发光源激发？是不是在探测器狭窄的检测波段里呢？仪器的参数要需要经验丰 富的技术员来实验。6 l( Y6 ^7 I" r" K" c
第七、双标记的细胞，对照组一定要做好。否则很难判断阳性与否。
4 q3 K! Y( ~1 r+ v第八、做实验要心平气和！尤其请人做。要知道没有一个实验是一次能够完美成功的。所以一定要有耐心。9 K) l2 D4 B  ]5 R/ Q$ y
祝你的实验顺利！要包包和威望哦！谢谢！

a86856635

那你的散点图怎么样，细胞碎片多吗。毕竟pbs里没什么营养成分。
6 ~8 t$ k5 o- a+ K" n' z# _下次把细胞一起带过去再处理试试把

a86856635

对了，你们是用胰酶消化的吧。有可能是胰酶把蛋白水解了一部分。用细胞刮刮下来再试一次吧

chaoruihua

回复 a86856635 的帖子5 ]+ d. ~3 E# E( h

, r, b' `( d  f* H6 j如果是用胰酶消化的，建议你将细胞放在培养基中，在细胞培养箱内回复一小时后再染色，因为有些抗原对胰酶敏感