293T细胞的培养

huangcong1988

这是之前看到的，别人做过的，关于293T细胞的培养的主要过程，在此，与大家分享一下：, O& H' u& _0 j7 s+ t7 Y& I# k0 u: L
（一）293T细胞的培养
/ q& C* n8 K) H8 e* _1.293T细胞计数
* h5 U7 J2 w$ ~, D& E# u7 o  ]9 E0 P' s0 r- F; S; u6 k  C9 u
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液
* H1 j% h# U, y2 N# c中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
$ Z; X+ ~  q* x& \1 v0 W细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
" W: K5 D& X3 C) \2.293T细胞冻存( }3 Y* M5 c; o; P2 k8 L
（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml, r9 f% h5 H  y6 g9 ^
（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混/ J! N/ G0 }+ s5 u. t
匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。* J7 z3 Y+ X- y0 v* N

1 U& j8 c: a* v( ~# D3.293T细胞复苏
; y: M7 n) \* B% E  o! t; }  k, g% n（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。
  v: Q1 C+ H- _+ j# e0 P（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。; N# ^/ d. Z" e& @' f. _" Y& C9 z
（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml& O9 {; |# o. s2 B! k7 _* {
含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
7 S; m" Q2 }  S5 p（4)次日更换一次培养液后再继续培养。
1 o+ q1 {7 h1 r* c1 l# v4.293T细胞传代5 ~; R: v; i3 h' ]0 ]! k
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
$ ?4 o5 u( [, |. D- S: Y后弃去PBS溶液。
! `$ q  f8 ^, c2 [（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。
% g* L2 g4 f, u/ v+ W. z4 x7 o/ i（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，: Z( M: N+ N: k
将瓶壁上的细胞冲洗下来。
- g' }% x+ `1 B（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
; ^+ J# t! Y2 J" `% F

nihaohao

谢谢分享

sailor

谢谢分享  补充一个小tip  我们实验室要求复苏293t时候一般会离心去除DMSO

huangcong1988

回复 sailor 的帖子6 b. o5 p1 h2 X& z7 a. _; z( r
6 W2 ]" F' I9 \6 z/ l
也谢谢你的tip，呵呵

ningtinglu

补充几点：1.冻存时先放入冻存盒中，缓慢降到-80度，再转移到液氮罐中；; x4 y& l. T& ^3 }1 P
                  2.复苏的时候操作要快，防止DMSO对细胞的毒害作用，另外要离心去DMSO;2 N0 s9 S2 T4 u8 U: D$ d
                  3.传代时胰酶我们用的是有EDTA的，终止消化后也要离心除去的。
4 G7 ^: j) T& G/ t( ?' g3 ~                  4,。培液和PBS要温预，要对细胞好一点。冷的PBS容易是293直接飘起来，都不用消化了。。。。:)( T+ O- M% O" k0 V; h7 q  \. s

牙牙丫丫123

想问问你们在培养293T的时候细胞中有没有出现过小黑点，这种东西会增多。这样的情况在细胞转染后特别容易出现。

牙牙丫丫123

回复 huangcong1988 的帖子
4 P7 y1 x. y" {6 e5 T7 M; Q6 x' K. C) s$ {+ k/ N1 C" j
想问问你们在培养293T的时候细胞中有没有出现过小黑点，这种东西会增多。这样的情况在细胞转染后特别容易出现。
. F2 k, K/ b# P

huangcong1988

回复 牙牙丫丫123 的帖子
6 M* l+ Q9 _0 b9 @
! K) L: s3 g% b* K- `$ p7 ]恩，是的，当293T养得比较稀的时候，细胞里面是会出现很多小黑点，不过当细胞密度大起来以后，这些小黑点就不明显了，我觉得这些小黑点可能是黑胶虫，细胞密度稀可能有影响，但是细胞密度大了之后，这些小黑点对于细胞就没什么影响了，现在的293T细胞株中多少会有这样的一些东西，不过，个人觉得影响不大

sccs1046

回复 huangcong1988 的帖子$ B) `  ]+ p: {$ q' N3 s! c
( {8 _% O$ D2 }; [7 U
我养的时候也有这种情形，刚传后细胞中黑点比较多，当细胞长密后，黑点就不见了，不知道是什么原因，不知道会不会影响细胞转染什么的？

huangcong1988

回复 sccs1046 的帖子8 b0 }! S% F1 M! ^* z- e$ j" R
+ z4 _. O& }; O" {) u+ A
我觉得这些小黑点对于之后包毒影响不大，因为细胞密了 之后小黑点就少了，还有就是小黑点与细胞是竞争，也是共生的，所以细胞密度一定要保证，不然细胞会不太好长，所以消化传代那些一定要保证细胞密度