流式免疫荧光检测

guosapphire

首先，你需要弄清楚你的抗压位置，是胞质还是核内？位置不同可能需要的透膜时间有所不同。
' i# l8 W" j* s2 T' V9 _8 B- U# q/ Y然后，找个阳性对照来判断你的操作有无问题；
: |% o" H. H: H  d" l最后，你可以尝试延长一抗，二抗的孵育时间和温度的改变。个人认为，既然你的细胞染色前已经用PFA固定了，根本就不需要后面的冰上操作了。
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future007

我做出来了，不过都修改了很多地方，说出来和大家分享一下啊。4度固定8小时（可能不需要这么长时间，但是我是为了调整我的作息时间）0.2%trition+5%山羊封闭血清通透15分钟，一抗4度过夜孵育，二抗室温两小时孵育。就可以了，以上是我改进了的地方，希望以后做流式分析的同学可以借鉴。能少走点弯路，谢谢大家的帮助

future007

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! b  w  v+ D) v1 Y: _/ L/ A( D% P2 E( _
我查的一个外文的方法，具体网站我记不得了，不过很多相关的方法都需要固定，你说的不需要固定的那种我也见到了。不过我选择了保守方法，呵呵

future007

回复 细胞海洋 的帖子& m) o5 m$ f2 u4 x

是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阳性结果

中的阳性改成阴性就对了。谢谢斑竹

细胞海洋

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* H+ g% T3 p8 W! B; ^" _
4 F- t4 ^$ p; Q9 O9 h已经修改 看一下

future007

回复 细胞海洋 的帖子% v; l+ J8 k8 g4 \/ r

) n. u" N1 x/ L, }6 N谢谢斑竹，已经改过来了

骨道边

做流式为什么要固定呢？固定细胞是为何？

RIVA2011

首先，第一次和后两次的染色方法一样么？有什么差别？为什么第一次阳性，二三次就阴性了 ?% Z  |7 \$ ~6 E2 P
你的方法中，我有几个疑问：
7 x* A! Q8 B3 T/ H! u0 Z+ c②        用2 mL 4%多聚甲醛室温（为什么要固定？）固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。/ B$ s5 O+ W9 E: a5 R* d& g3 T
③        用1 mL含0.2% Triton-X100（检测的是胞内的？）和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
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