流式免疫荧光检测

future007

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# z! ^) d, v1 u9 u' P我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：3 {* x. v$ C% m8 q( L1 @
①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。9 ^5 O. ^6 C% q8 t' |. @
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。  c/ M% h2 f' Z' B: r5 B+ u3 V
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
- o# ^# j- b. G% P$ X$ z* [④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。1 ]; r; I2 _% k4 h7 p- w7 M, R9 g
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。4 c- t1 V- ~; e! a
⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。; V- X5 X5 ~3 {  U" p
⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。( v2 O# G0 O9 _5 |) m2 K+ M. [. [
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。
9 z- H( b! s- {, e8 e我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀
# F, w. y1 M2 C; W( R看来你有悲催了
) C( j% ^8 d3 L% s$ ^5 Y6 W5 p要不在试试做一次

future007

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4 H, `& R; `- @- S) G; I. m7 x# T7 X8 ?; B8 G. S7 O" b
我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了# d1 [4 e1 A4 N: Q; |7 g

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

回复 czzhaozhu 的帖子- M- E. B) i! H* V. V* X1 c1 E

" F0 h- O5 Q/ `' t* X说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 , B3 p) c: R9 X* ~  m
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

. H+ Y4 Z+ q* f; p$ ~' Q- @上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

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  S* X7 ], V* Z! N7 s# v, ~
0 Q0 }4 e& s: i& j: F6 S具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？