流式免疫荧光检测

future007

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% F- f3 z; @- a; R( \1 `; n我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：  M5 n& ]7 Q# p
①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。9 \1 h3 K8 ^$ T$ a/ @! O
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
, |4 P! ]& ?# b9 [  D- O4 R& N6 V③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。+ H( X/ i* |1 m/ U
④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。" R+ w2 Y- B- r: k
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
) H' n* j! c0 k5 H% T5 \⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
9 S% j. O; ~5 c. B& t& J⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。
  L' A6 O( @5 `# ~+ k/ i# @' \+ R我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。6 L$ j/ S4 ]; G$ Q2 }
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀
  L: O. i+ U! W1 @% X0 W看来你有悲催了
& E, ], |$ G- q& W& P8 a要不在试试做一次

future007

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6 `6 u9 r& R& N; U9 Q# e3 J% u8 \  L, b
我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了% O1 a8 i& _5 V- D

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

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- x9 S+ S, c  N$ R
! o  N8 K% ]; b/ t  T- u' C说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 8 ~; Z' o! P* l- A/ E+ t
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

2 d. l0 v, h6 k( I
上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

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8 S0 m2 W- [' z6 P+ u% J! K, V& Q! w- f8 I# y' L: C: ], R, }6 I) |
具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？