流式免疫荧光检测

future007

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# M3 |  `, h2 [- x& u7 ?" d. x我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：7 M( u9 S2 ~9 i0 U8 D
①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。$ z' f; x9 l6 ~  ?; m( s
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
: W6 t8 j1 l% K& e+ ~* R6 y! g" J! h7 ]③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。  ^/ O- G/ M" _; w' W( L' y
④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。- S  Z$ W. L( ^, Y2 F6 }
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。) n. t5 ?! l& q2 O3 R
⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
8 V  K6 o1 Z% j9 H9 v⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。9 U4 P8 |9 `& I& }# U
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。4 a0 V' J+ c( e8 w
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀
4 c% ]: s+ B, E" s+ \  ^9 v/ S看来你有悲催了
/ T3 o5 \" O4 M要不在试试做一次

future007

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$ g' Q. v4 P( u5 X" W我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了& ~9 ^$ \% e  p9 S4 C. O

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

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+ U* b$ o  F" Q2 y' j1 `: Z& s5 n: G3 F& r/ c* f+ l
说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 & U- k; d2 W, V; Y8 C9 d2 `8 I4 N
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

/ v" s% Z% W9 Y5 u上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

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8 W' X* K- \( [' S+ p, A7 G1 S! Z7 j
具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？