流式免疫荧光检测

future007

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我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：% S0 w2 |5 q' y' \6 O, y
①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
% y  s6 p& x! ]: x* ]4 x2 \②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
$ c% b. I. K5 h% l% C③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
7 p+ \' c% x9 N5 ^④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
# n( [2 ~- n9 V⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
; W0 [$ F& y! l8 f⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
9 E9 {7 U' o/ y3 K8 i* u, Y1 ~; D⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。8 x! J- V0 Q  y8 L! c9 B) u- a
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。1 \) M: z; Y2 ?+ S; @& @/ q9 I7 m
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀
" f4 D8 L  U. V2 S看来你有悲催了
  k+ E3 r* K3 I: D5 ]要不在试试做一次

future007

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1 P* \+ a& r. y; E! ^6 h. |6 z4 N9 @7 k9 n, c7 f4 m5 t- u  S
我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了
4 e, [- j& `; ~& @$ C" o  Y  P

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

回复 czzhaozhu 的帖子/ B8 p2 |. o% m3 D. z# c7 h6 h
* A4 S# Z) s5 \4 Q: e& D8 F* n
说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 0 m+ N5 }: Z7 f7 b0 P
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

  ~& A8 r5 g( B- F% @* p/ `! p上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

回复 future007 的帖子! i3 a# E: `* B  c; e7 f6 I; ^

8 ~5 q! u. S3 |% J% O$ j具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？