流式免疫荧光检测

future007

* Y  S  d$ \! I( ~. ?
0 O- Q, q( e* t- l" U, [我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
/ L$ B  L# W. a! U; y4 b1 {: |! D①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。# L' U$ u. S6 }( g. S$ j* H% j
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。, ]; X* c5 J8 w( l6 Q) U9 y
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
- q+ j$ g: D' ]/ ^④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
' {0 \9 e6 w* R% X0 Z( Q⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
# M: }* i1 |' p+ w# G) b9 q⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。9 ^$ X# z* U: X) _4 S2 b' L
⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。1 `! O8 c6 P( f, y  z2 q" N6 p0 y# X
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。) H) l  q/ y7 `8 U
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

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回复 jhu132llh 的帖子* x9 U% A5 x4 z; A+ t2 w& ^

* ^- M" L' [  @我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了3 X3 p9 J4 G% H$ [

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回复 czzhaozhu 的帖子
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$ a% c9 F0 H! d3 D说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23
+ X" {( e- F2 H6 z& @我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

6 Q3 F! }$ |* X. }: P% b& u
上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

future007

我做出来了，不过都修改了很多地方，说出来和大家分享一下啊。4度固定8小时（可能不需要这么长时间，但是我是为了调整我的作息时间）0.2%trition+5%山羊封闭血清通透15分钟，一抗4度过夜孵育，二抗室温两小时孵育。就可以了，以上是我改进了的地方，希望以后做流式分析的同学可以借鉴。能少走点弯路，谢谢大家的帮助

future007

回复 daviddow 的帖子/ S. m: W  z5 y9 Q+ n

, J) d; x1 z+ U4 H+ L我查的一个外文的方法，具体网站我记不得了，不过很多相关的方法都需要固定，你说的不需要固定的那种我也见到了。不过我选择了保守方法，呵呵

future007

回复 细胞海洋 的帖子
7 V6 W* u* N) e: z1 Q) d* E

是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阳性结果

中的阳性改成阴性就对了。谢谢斑竹

future007

回复 细胞海洋 的帖子! ~, g( d' G2 t4 K5 s3 ^$ ]
; {9 Z# I5 d4 P) `5 }8 V' B4 p
谢谢斑竹，已经改过来了