流式免疫荧光检测

future007

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% {$ Y/ O' n8 v; j, J* V, @8 N我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
  }8 m* m: e' i: U% j①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
: g; i* x  a7 _/ {4 l( h; l, d7 s②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。7 }8 @; `: f% \$ {5 i/ Z
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
3 O7 b4 b  A- M) O7 r4 |" o6 w$ u④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
8 k( H9 y; D& N+ n. r2 W- I* x3 @⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。) q6 }0 l& R% ?4 T
⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
" v+ f0 S  J6 R6 r+ l⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。% _' w5 }- @4 j
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。' a# u2 Z3 R+ z( d8 X. Y
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

RIVA2011

首先，第一次和后两次的染色方法一样么？有什么差别？为什么第一次阳性，二三次就阴性了 ?
: Z) E# i- x# G& h你的方法中，我有几个疑问：
4 \% l& @4 F8 e2 ~- X. \* i. v②        用2 mL 4%多聚甲醛室温（为什么要固定？）固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
4 N  G* O! C+ ^4 c8 j2 v③        用1 mL含0.2% Triton-X100（检测的是胞内的？）和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
4 q, d& H; G$ }

骨道边

做流式为什么要固定呢？固定细胞是为何？

future007

回复 细胞海洋 的帖子" L+ m" C+ x2 P# W  M  R" h

9 p0 E4 ?2 L9 W+ |) H谢谢斑竹，已经改过来了

细胞海洋

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- L" p5 r- s9 A2 T! O+ g  Z: i7 X3 H! S$ F- P; t3 ^  z
已经修改 看一下

future007

回复 细胞海洋 的帖子
8 {" F/ ^+ J) l# h

是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阳性结果

中的阳性改成阴性就对了。谢谢斑竹

future007

回复 daviddow 的帖子
8 W8 G& z5 v4 o  S3 r
2 t% B) \/ m" @我查的一个外文的方法，具体网站我记不得了，不过很多相关的方法都需要固定，你说的不需要固定的那种我也见到了。不过我选择了保守方法，呵呵

future007

我做出来了，不过都修改了很多地方，说出来和大家分享一下啊。4度固定8小时（可能不需要这么长时间，但是我是为了调整我的作息时间）0.2%trition+5%山羊封闭血清通透15分钟，一抗4度过夜孵育，二抗室温两小时孵育。就可以了，以上是我改进了的地方，希望以后做流式分析的同学可以借鉴。能少走点弯路，谢谢大家的帮助

guosapphire

首先，你需要弄清楚你的抗压位置，是胞质还是核内？位置不同可能需要的透膜时间有所不同。' W1 R! G4 D- |$ h, t; g% }( A9 Q
然后，找个阳性对照来判断你的操作有无问题；
1 w! x" |, b* L* U/ i) w最后，你可以尝试延长一抗，二抗的孵育时间和温度的改变。个人认为，既然你的细胞染色前已经用PFA固定了，根本就不需要后面的冰上操作了。
$ A# j; t: ^" v/ i

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？