流式免疫荧光检测

future007

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! n0 i7 R: o4 i, U7 Y! Q8 N/ I) t我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：, E% n1 ?* z4 a! [: l
①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。+ X4 i4 O3 h3 W! r! q# D; }
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
$ a. y* S. H+ x- P4 m( l③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。% i! y$ V& N: Y1 ~& f' b: M" d
④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。; }7 p2 B, y. k7 K* B1 R+ i
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。% [) W; @3 S/ M$ ^& h* G
⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。! ?7 x- s2 C# r
⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。1 n* y% R$ X- H2 X
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。# t7 ^7 `/ ]* ?+ Y0 |
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀
; k: A4 m+ t6 d' u3 M5 f) e0 P2 T看来你有悲催了
$ u! v. {  R4 \  c要不在试试做一次

future007

回复 jhu132llh 的帖子- O* x; Y8 S: f3 v# L
. r, `3 z8 s  D$ Q: H6 @
我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了
) a0 }. D! _/ o, e# k

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

回复 czzhaozhu 的帖子) ^4 S( h/ t" ]5 R! K

9 [/ o6 Y7 n$ ?) I9 l. l4 Y说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 / B3 a; S) ~/ K- T
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

6 g8 q! ~3 U; ^" F  B上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

回复 future007 的帖子/ Y% g, B9 {& e6 d
9 Y' @$ L( G, G: n2 J, ]3 ~
具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？