流式免疫荧光检测

future007

8 G( F, \; S6 g2 `" z  x

2 w8 _. m$ o8 R! i) l" Z我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：. M4 h' o2 m) l
①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
" T* U0 d; W- W2 [②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
! P9 {& k! U  y9 j③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
1 U  w* v2 N8 N; v& v4 ?7 E④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。3 ]9 e8 P; M5 ^% R' O" q: X0 ?
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
4 @8 E$ x, I! ]0 Q/ Q- p7 i⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
( V% D# M# t& C0 O9 }+ p3 c⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。
3 @$ w% J! Q# r' |# I我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。9 V, A( v! J4 x! n0 y+ z4 s4 r; c
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

RIVA2011

首先，第一次和后两次的染色方法一样么？有什么差别？为什么第一次阳性，二三次就阴性了 ?( V0 X( ?3 b/ Y, c# R0 i
你的方法中，我有几个疑问：4 C3 m5 K7 s' Q  C9 b" U! ~, |
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温（为什么要固定？）固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。, _, p* D2 h+ Q7 w$ t5 ]/ d+ U& M
③        用1 mL含0.2% Triton-X100（检测的是胞内的？）和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
8 G) m4 F/ `; W8 i, {

骨道边

做流式为什么要固定呢？固定细胞是为何？

future007

回复 细胞海洋 的帖子
3 X# J5 E/ {- k5 c# ~) G! J4 I/ Q( W4 b
谢谢斑竹，已经改过来了

细胞海洋

回复 future007 的帖子
! _. {$ J, \  W' a$ B
" u/ {# ^2 W4 p* S已经修改 看一下

future007

回复 细胞海洋 的帖子  H7 B: F  s7 j2 j- _# G

是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阳性结果

中的阳性改成阴性就对了。谢谢斑竹

future007

回复 daviddow 的帖子# ~3 h% Q/ K# e. T, G; @
( n* b  U9 j# t$ O
我查的一个外文的方法，具体网站我记不得了，不过很多相关的方法都需要固定，你说的不需要固定的那种我也见到了。不过我选择了保守方法，呵呵

future007

我做出来了，不过都修改了很多地方，说出来和大家分享一下啊。4度固定8小时（可能不需要这么长时间，但是我是为了调整我的作息时间）0.2%trition+5%山羊封闭血清通透15分钟，一抗4度过夜孵育，二抗室温两小时孵育。就可以了，以上是我改进了的地方，希望以后做流式分析的同学可以借鉴。能少走点弯路，谢谢大家的帮助

guosapphire

首先，你需要弄清楚你的抗压位置，是胞质还是核内？位置不同可能需要的透膜时间有所不同。8 \4 D) Z% c. h, w& k$ R0 k
然后，找个阳性对照来判断你的操作有无问题；$ f& s5 Y& w  @2 p
最后，你可以尝试延长一抗，二抗的孵育时间和温度的改变。个人认为，既然你的细胞染色前已经用PFA固定了，根本就不需要后面的冰上操作了。
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daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？