新手有个问题？

如来的观音

打个比方说，研究干细胞向终末细胞分化，我们可以从蛋白方面和基因方面来鉴定是否分化。蛋白方面可以做类似于western的检测方法，蛋白标志物可以做免疫荧光、流式等，基因方面可以做PCR等，那么怎么选择半定量PCR、实时定量PCR还是逆转录PCR呢？

grape

首先明确三者的原理及差异：" c: J, U% s: A! \: C

3 _- Z6 l9 Y+ L+ P) \$ n8 {6 g. P1、逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）：) t' r& i/ s8 Y8 a* k
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
- v) T7 s5 a4 F- c- b$ G4 Q/ b& v" U, u) ~
2、半定量PCR（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）:  K# }' P5 ]& Q! n" H' |: ^
是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。 这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。
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3、实时定量PCR(real-time quantitative PCR, RTQ-PCR)：
1 i; I, Z9 Y  Q3 M* rRTQ-PCR属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
0 g6 Z0 t3 t1 A. f4 j/ t; q; U3 ^4 O8 c7 f9 ^! P6 b2 l
三者区别：( b. e$ P, T% q: `, o# u9 D6 ~
1、半定量RT-PCR与荧光定量Real-time PCR最大的区别就在于 semi-PCR需要跑电泳，根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低；/ A$ d/ u' \4 v2 J
而Real-Time PCR则无需电泳，可以实时监测整个PCR的全程 并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低；可见 semi-PCR不如Real-Time PCR精确。+ o: o; v+ F8 |# b! g* v

- c( O9 x+ Y. G2 K; w/ d2、RT-PCR只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量；
$ D$ n& \9 X0 Z, r" F而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。所以real time-pcr更精确些。
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个人认为，三者操作方法虽然有所不同，但基本原理类似、殊途同归。对于研究干细胞分化，没有选择哪种更好的必然性。个人认为如果有条件的话，选择实时定量PCR更精确些。+ \( T3 A3 {+ H- P; I; p/ {9 z6 |, b

如来的观音

回复 grape 的帖子9 \+ T) V$ T+ @  Y' C8 z  _! a" r
, C" C  B& V1 p$ @! j; S% R
非常感谢

iamwentworth

呵呵

iamwentworth

呵呵