新手有个问题？

如来的观音

打个比方说，研究干细胞向终末细胞分化，我们可以从蛋白方面和基因方面来鉴定是否分化。蛋白方面可以做类似于western的检测方法，蛋白标志物可以做免疫荧光、流式等，基因方面可以做PCR等，那么怎么选择半定量PCR、实时定量PCR还是逆转录PCR呢？

grape

首先明确三者的原理及差异：
0 @, ~+ J/ H6 g* s1 t2 t3 q; o2 j9 V
8 j3 m. b  i( Q1 s. _( W4 L1、逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）：8 D! N* R. I4 P! {2 Q& I  D
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
7 o/ S9 E4 J2 f; H; b9 ?4 b/ g+ V; c5 f! e3 r
2、半定量PCR（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）:6 ?9 p  p7 ]3 R: n7 Y+ P
是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。 这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。9 C3 ^+ `6 F  J# L, ]3 u" a

, R( i  p1 i' f% g7 Z* t5 @0 z2 b3、实时定量PCR(real-time quantitative PCR, RTQ-PCR)：
- [: X) T. o* }- C- l6 P, ]4 @0 iRTQ-PCR属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
6 ?9 E" d+ z% `! M. Q9 l# m% h8 h$ ], u6 R; y2 E% {5 X$ Q
三者区别：; E8 N  \; T6 m
1、半定量RT-PCR与荧光定量Real-time PCR最大的区别就在于 semi-PCR需要跑电泳，根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低；2 P( L3 [) y: n/ u0 x) x6 A, g
而Real-Time PCR则无需电泳，可以实时监测整个PCR的全程 并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低；可见 semi-PCR不如Real-Time PCR精确。
# b9 n( n# b2 c- Z
- n- }0 s( n, O, K3 \2、RT-PCR只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量；) z# W; k6 s% Y
而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。所以real time-pcr更精确些。
' @2 O# U  b2 ^: G! S4 K! z
; B, O; u1 C9 Y/ C7 J9 S1 C4 K个人认为，三者操作方法虽然有所不同，但基本原理类似、殊途同归。对于研究干细胞分化，没有选择哪种更好的必然性。个人认为如果有条件的话，选择实时定量PCR更精确些。
, t$ @! r. H# x, z  k6 |1 B

如来的观音

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7 d7 Y# k  u8 ~4 ^! J- s9 k) N( V  f/ P- e( D
非常感谢

iamwentworth

呵呵

iamwentworth

呵呵