WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

zhenhua

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5 P8 r; c+ a6 N8 B! [, j# d8 C6 }6 _2 ?, O
20ul足够。5 \7 k4 k2 e  G  L+ f5 r( z
煮20-30分钟不会使蛋白降解。
% d* H3 p- ^4 |* I不用离心去沉淀。煮完几乎没有沉淀了。: C1 P4 Z. I+ L' D4 K5 G. L8 P
可以用actin等高丰度蛋白试试效果。2 e# a5 L$ H4 M9 V' M" h4 Z

lifangamanda

Zhenhua版主，煮样温度，温度？？？谢谢！

wenyangapple

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" o3 y/ @8 U' l4 K- |3 l, k- c4 m0 d0 q& Y* s* R( U
右侧是好的结果吧？左侧比较糟糕的data最大的可能性没有裂解开，从上面那些黑色的渣滓量比较的大但是下面条带却很细能看出来。裂解buffer的问题可能是pH不对，或者是SDS or NP-40之类的加的不对。

wenyangapple

回复 hndxws 的帖子
% x* e* l- J. M& Y/ A
' n( k; v  s& e2 A  Z$ c6 p5 {我觉得你这个是蛋白没有提出来，或者提出来的蛋白降解的比较严重。

pheebs

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25 # {; X. l0 @. U# s7 A" u
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
5 n$ I* s5 K( j$ B# {+ E4 p6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？1 n9 D  ?! |: y& x
...

7 I7 n, Z) L( n3 u
煮这么久，第一次听说。。。

细胞海洋

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. @( }' w. N) h3 }8 d1 s
+ J5 j! L6 O+ T点击Zhenhua版回复帖中的回复按钮发言 像我这样 否则他不一定会看到

chb611301

我觉得先检查一下配的胶，是不是SDS和Aps的问提，胶凝的情况。其次是样品处理一般都是煮样15vmin，都没有问题了。我们常规经验脱脂牛奶封闭要2小时会比较好一些。二抗稀释浓度一般都是1:5000，到1:8000都可以的。

7ubo

回复 wenyangapple 的帖子, w0 h+ A4 L1 ~! ^! G4 Z) l
. t% J, Z  l& I( }7 _$ T
长满的6cm的皿的293T用200ul的SDS loading buffer裂解的，是不是加少了？

7ubo

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' `$ o: X- b( ?0 A* y% A& \0 q/ }. |- e
APS少加点是不是比较好？

lifangamanda

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, K  l- h' R8 Q: a. m
# ]0 f4 j- V2 _; E; T多谢海洋哥！