WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

张也行

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: x+ I4 v$ ^6 V直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。

张也行

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4 r1 n  o% F* ^" d! m& k1 u# y+ z7 K4 o: d1 m9 Z5 ~
我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。

hndxws

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6 o2 e6 C, t, {8 o# @2 E* p2 j; I6 f7 ?6 W! w
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

shuixiao

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) U% k$ ^( ^4 Q5 }$ F8 F5 s7 Q. y2 a% ^/ P' W
BCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。
% D- b- T4 D, }. Y5 t( H# }我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

7ubo

回复 hndxws 的帖子5 D+ s5 n/ b3 Z

# |! B. b! T& p2 t, z: ~朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

张也行

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0 W: A5 r9 ]) ]+ E  c6 ?# P7 j! {$ S$ {
一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

Learner

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0 p. r% m( l! O; \. W  C2 e! k) ]
1 V7 k3 x6 S* P- d. \; O& T蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

hndxws

回复 7ubo 的帖子8 O0 H7 g7 W- @2 M+ l; ?/ n

7 S: F5 s3 F: v带GFP的小鼠囊胚

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25
$ r+ V1 O* l5 _! `+ p呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
" ^* q4 I8 M& Z8 z3 W% w+ q- a6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
0 {7 C2 y6 c. ~+ l/ P/ t ...

- L% }, J0 [$ i1 i
请问煮样20-30min，温度？

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？