请教：PEF怎么了？

shihuijunm

导师花高价买了头怀孕33d的母猪杀了，叫我取胎儿做猪胎儿成纤维细胞，我们用的是胶原酶消化法，培养时FBS的浓度是20%，培养液里加了1%是NEAA和GLu，传了1代后细胞的状态非常不好，还请各位大侠帮忙看看是怎么了？
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shihuijunm

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sdjjfangfang

细胞怎么这么密呀？是不是早该传代了啊？还有图片好像不是很清楚。
: ^& A4 x! a3 b, c3 C/ ^; q" L原代的细胞在传代的时候对细胞的密度要求比较高，千万别传稀了。6 G6 n3 y7 |0 E' `+ P- M
培养该细胞的营养条件是可以的。你的细胞在原代的时候状态好吗？现在状态不好，会是由于在最初消化的时候消化过了吗？还是在传代的时候消化过了？

shihuijunm

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消化液是用胶原酶和DNaseＩ配制的，最终胶原酶工作浓度为：200 unit/ml；Dnase I工作浓度为 25 unit/ml，我们消化了４小时，细胞在原代的时候状态就不是很好，传代的时候用０．２５％的ｔｒｙｐｓｉｎ消化的，大约２ｍｉｎ，不知道您在分离的时候是用什么方法，需要注意哪些方面，我们以前没养过这个细胞，没什么经验，还请多多指教啊～谢谢了

sdjjfangfang

我们做的不是猪的成纤维细胞，但是分离过其他的成纤维细胞，用的方法是组织块贴壁法。你可以尝试一下，我们觉得效果还挺好的。我们之前用ｔｒｙｐｓｉｎ消化的时候也是消化不下来。尝试了这种方法之后觉得还挺好的，纯度也比较高，获得的量也比较大。

shihuijunm

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$ g; Y: H) s2 v# ?8 U3 C我们也用了相同的消化液做了MEF，效果好像比猪的好些，具体原因我们也找不出来，还想请问下在用组织块法做的时候有没有什么特别的要注意的地方呢？有详细点儿的protocol么？谢谢了. T- W* A4 ^. r: l% {! \6 U
老鼠胎儿成纤维细胞

sdjjfangfang

哦，MEF好像还可以，我们之前做MEF的时候是用ｔｒｙｐｓｉｎ消化的，状态一直都还可以。
1 {0 Z2 Q) J& ]( U$ ~7 Q, g做组织块贴壁法的时候就是将组织剪切成小块，贴在T25的瓶里，刚贴时尽量避免液体，等组织块贴牢后，补加相应的培养基即可。

wjy2003123

楼主的PEF早该传了  我们这里经常做PEF

shihuijunm

回复 wjy2003123 的帖子* Q/ c: d/ ]6 G5 ?  L; B

4 a# F5 p" L( Q" t. U/ M是吗？太感谢了，不知道PEF能传多少代还能用啊？你们培养的时候用的是多大浓度的FBS呢？有没有详细点儿的Protocol可以提供呢，不甚感激~~老师催得紧，又没什么经验，还希望多多帮助~谢谢了