急求：为什么我的小鼠sv129胚胎干细胞一直不贴壁

前途似锦

你这个问题非常严重，一个个摸条件吧 ，不贴壁可是大问题啊

第七舰队

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3 [; `0 E) d( s. W8 x. N8 B3 z
( {. p: Q1 P3 n# \7 o+ {( H* R根据你的经验，不贴壁的原因有哪些？

dilal

4 C) q+ ]# L. Y; r1 w替楼主上传的图片，是用相机透过目镜拍的，250x。# _' i; @: S% d! R
个人感觉feeder密度过稀了，ESC集落比较小，形态还行，由于是通过相机透过目镜拍的，细胞集落的边界、遮光性、细胞核状态无法明确。
& r' |+ |: ?. b3 q如果有条件，最好用带有摄像的显微镜拍摄下来。

dukang

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是从别人那传的一直在养的细胞还是复苏的以前冻存的？
. w& R1 ~5 I+ F2 Q饲养层的密度一般是伸展开后可以铺满皿就可以，小鼠的ES细胞对饲养层密度要求不高，但饲养层状态要好一些。小鼠的ES细胞密度大一些比较好，但不贴壁跟ES密度关系不大，诱导时一个克隆也是可以贴壁然后传代的。
, c5 L& v, j3 H4 S& S4 `/ \4 L) \培养基用之前过滤没什么影响

第七舰队

是从别人最近冻存的，然后我们买过来的，同批次的细胞，他们复苏效果很好，我们所有的培养基和细胞都是和他们一样的，现在的问题是，我复苏了之后，第一代还挺好，ES的密度我也考虑到了，但是传代后，开始不贴壁，细胞克隆不长大；这种情况，已经出现三次，每次传代后时，胰酶消化大约1min, 我吹打也很注意。所以很无奈了

第七舰队

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是从别人最近冻存的，然后我们买过来的，同批次的细胞，他们复苏效果很好，我们所有的培养基和细胞都是和他们一样的，现在的问题是，我复苏了之后，第一代还挺好，ES的密度我也考虑到了，但是传代后，开始不贴壁，细胞克隆不长大；这种情况，已经出现三次，每次传代后时，胰酶消化大约1min, 我吹打也很注意。所以很无奈了
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dukang

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3 w' E4 F" Q7 k* d8 M7 y; A
1 q2 `4 f, o7 k7 L# h照这么说应当不是细胞的问题，你取一部分细胞消化时0.05%胰酶消化3min试下吧--我们平常是消化3min把ES细胞消化成单细胞，然后饲养层状态好一些--不保证会好，但试试吧~

dukang

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- F( E1 ?8 R/ G( k! l; x( Afeeder太稀了，铺满皿最好~

第七舰队

回复 dukang 的帖子$ Y1 L3 Y" ?0 Q, X$ ^9 n$ O* e1 G
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我试一下吧，我现在用的是0.25%的胰酶，我再把饲养层铺密度增大一下试试；还有一个问题是我昨天测了一下培养基PH，发现过碱，PH8.9，这可能和不贴壁也有关系

前途似锦

回复 第七舰队 的帖子. {2 n/ Y" W7 d  c

, R9 }- k+ `6 Z; @' T) l8 U; G2 h饲养层不好，在严重的问题就是考虑培养基了