MEF复苏死亡的原因

573639471

最近冻了一批MEF，复苏 过夜贴壁后 大量死亡，贴壁的是小点，没有细胞伸展的样子，怀疑是用冻存液重悬后因为要分装好多管，所以细胞在DMSO中待的时间太长了。不知大家遇到这种问题吗？

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很可能。DMSO对细胞损伤还是较大，加入DMSO冻存液（内含20%血清较好）后，立即悬浮细胞并存4度冰箱，再转入-20、-80度冰箱和存入液氮。也可能冻存前细胞状态就不好，以及胰酶消化时间过长、未使用血清灭活胰酶等导致细胞损伤，冻存复苏后就不易存活。冻存时细胞密度大一些较好。

sdjjfangfang

加入DMSO后应该尽快将细胞放置于4度或者是冻存盒中。但是我们之前也有要分装80多支左右的，也没有出现你那有的现象。细胞消化时没有消化过吧？如若是梯度冻存，没有弄错时间吧，如果是用冻存盒冻存，那冻存的时间够吗？复苏会有问题吗？是所有的MEF都这样， 还是个别现象？

懵懂干细胞

个人认为MEF细胞冻存复苏最影响存活率的三个主要原因：1、冻存液悬浮时间；2、程序性降温阶段处理时间问题；3、37°复苏时间！+ `* w2 z4 {4 R1 g+ Y/ ^0 i
至于冻存液成分问题应该在绝大部分实验室都没问题的！

573639471

回复 懵懂干细胞 的帖子# _& S( a3 |" k- k

# q' j. L+ c: w" O$ ?. X2 o. G( ~关于第二个问题，我现在用的是 异丙醇冻存盒 放在-70 过夜 一般protocol上也是这么说，这个时间很重要吗 多长时间最好？

懵懂干细胞

回复 573639471 的帖子' i5 U+ r6 U* q* [# B3 l2 T

# m+ q! Z+ ~+ y/ H5 I4 A% r我所说的程序性降温是指4  -20  -80 处理时间！
0 U% o. ?% ~5 o) C+ c: \( `3 q$ M0 k异丙醇程序降温盒-80过夜是可以的！

scottist

我之前也遇到过类似情况，总结原因有：1，-80度存放时间过长（1个月左右），我直接放在异丙醇冻存盒里，忘记取出放液氮了，结果细胞大部分死亡，较少贴壁；2，复苏后要加适量培液冲洗，离心后弃含DMSO的废液，新鲜培液重悬，如不加冲洗也会出现类似情况；3，铺明胶可增加MEF贴壁率，不铺的话，贴壁率会明显降低。

fananran2003

复苏时最好转移到15ml离心管理，加一些培养液进行低速离心去掉DMSO 后进行铺瓶，这样可以减少细胞损伤。还有就是原代或代数低的细胞贴壁能力弱，最好铺上明胶。有些原代细胞在低密度的情况下会生长不好，只有达到一定的密度才能良好生长，你mef复苏时密度不要太小了。想细胞复苏不回来的原因可能有三个时间段的情况，细胞冻存前，冻存时，以及冻存后。冻存前细胞生长状态（细胞活力）不好，或者处理的mef太多，胰酶消化时间过长。都会影响复苏的存活率。冻存时，细胞冻存液中放置太久，冻存时一定要把冻存液先混匀后在和细胞混匀。不要把冻存液和细胞一起混匀。细胞娇贵可以增加血清含量。4  -20  -80 处理时间的长短自己要掌握。冻存盒没放置一周没问题（自己没有忘记过比这更长的时间了）。复苏时，37℃时间不要太长（最好让里面有一点小冰块），离心时要加培养液保护细胞。第二天换液。多注意些应该没啥问题哈!