慢病毒转导mES之promoter选择

christophe

最近用慢病毒向mES中转一个基因，病毒是经过50000g离心浓缩，TU值足够高，感染293T和MEF是没问题的，但表达GFP的mES克隆基本上没有。请高人给分析一下原因！另外，GFP的promoter是CMV, 这个是不是在mES当中表达很低啊，CMV \EF1-a\PGK\CAG\MSCV这些启动子在mES中哪个是最适合用的啊？

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本人开始也是使用含CMV启动子的载体，但在ES中转染效率非常低，于是使用由3中启动子合成的CAG，发现质粒的转染效率提高至少10倍以上。使用慢病毒载体，我使用过CMV \EF1-a\PGK三种启动子，CMV最差，EF1-a最好，PGK次之。根据我的经验，建议使用含EF1-a的慢病毒载体，我记得Invitrogen有售。含CAG的慢病毒肯定也会工作，但我没试过。另外做ES转染。不要用GFP，可使用Venus荧光蛋白，比GFP亮10倍，也是绿色。使用CMV启动子做其它干细胞转染，效果相对也较差。

深海寂寞鱼

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! r" I$ [% Q2 @" M     to christophe战友：( K' Z/ R  W/ r" K
: U! e1 P: g: m, j4 j+ X
     mES中确实存CMV启动子的转基因沉默问题。' K% A) R* x7 Q, [/ {7 t3 Y& O
7 L6 _+ a- c$ M1 e5 g
     广 州 赛 业 前一段的培训中也提到过这个问题。# U( J% e' H, `
( c1 J- B9 {/ L, z- G8 B1 ]/ ~
     我们实验室Reading Report时我还讲过相关的一篇文献，我给你找找看，如果能找到我会上传到下面。
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- {; Q. N' X( n, B; r* p     解决这个问题的方法是换用CAG或者EF1a启动子。# M  H' c# k4 C: B( o0 l
. Z3 h8 S6 f* U8 o/ W+ w6 v
     以上只是我对这个问题的一些初步了解，如果有问题欢迎继续交流。

christophe

回复 username 的帖子) R5 J: S1 t0 T3 l8 C6 ?$ T

: J( E* ^7 o" a' V谢谢你的宝贵经验！看来我需要换一下其他的启动子了。再麻烦问你一下，你做慢病毒转导mES效率能有多高啊，有什么关键步骤需要特别注意的吗？做慢病毒感染mES快两个月了一直不是很成功。

christophe

回复 深海寂寞鱼 的帖子3 l4 E1 x- @& w9 c2 m
- @6 h' p  U6 f! A8 x
谢谢！那你了解CAG OR EF1a 比CMV在mES中的基因表达效率能高多少倍呢？我也找到一些这方面的相关资料，贴上来一起探讨一下。

christophe

在第二个资料是关于lentivirus转导hES的，在Page127 有一段话：When applying lentiviral vector-mediated transgenesis in hESCs, the most  critical  issue  to be  considered  is  the  selection of  a promoter. Another  critical  issue  is  the  selection method  for obtaining  a  pure  population  of  transfected  cells.

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5 f4 M5 F0 g- i' d/ w, q8 u& M4 M: C% y) e' V( x1 f# Q$ w" d
我做通常转染效率在60%左右（60%细胞表达GFP）。几点注意：1.我使用293FT包装细胞，而不是293T细胞，包装效率会增加一些，这细胞Invitrogen有卖；使用生长较好的293FT细胞包装。2.我使用Invitrogen出售的包装质粒，含三种质粒的混合。2.使用新鲜制备的病毒感染，mES也同时保持良好状态。3.使用悬浮细胞感染，总体积在1ml左右，感染3小时左右，每30分钟摇晃含细胞的离心管一次。我相信你的细胞感染效率低是启动子问题，换CMV后会改善。9 u* _( G9 B1 B& d6 r% l
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2 A, M  q/ I1 V6 ~ 参与/回复主题 关闭 5 K% X- p$ A" C/ B

christophe

回复 username 的帖子5 v" k% D$ W, z; m! ~0 {$ T8 M

1 g4 b8 o& @4 b6 C谢谢你的建议，你的效率真是挺高的啊！
% s# T8 r+ D5 ]2 E' S; Q+ z我换一个启动子试一下，有了结果再交流！

Elaine韩

实验正好遇到此问题，总算找到组织了，呵呵。
* j/ \- e/ z. u5 ?- G+ h我想了解一下，是不是说在诱导过程中所用的SKOM四因子不用CMV promoter的vector？2 l6 Z, T! j* H9 q; k0 Z) v+ B( X
看了上面的文献，假如我用CMV promoter的vector转染诱导成功的iPS,目的基因也会表达不强，是这个意思吗？" u" |3 b# o- b0 P$ N7 ?7 g
但是实验室资源有限，现在手头有的就是CMV的，那该怎么办啊？自己重新构建？

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回复 Elaine韩 的帖子& `- d, U5 j( R2 f$ c8 R
, g9 K0 I. t1 N* q6 P5 ]+ Y
制备iPS使用的是成纤维细胞等成体细胞，因此CMV是可以的，而转染ESC等干细胞时需注意启动子的问题。