慢病毒转导mES之promoter选择

christophe

最近用慢病毒向mES中转一个基因，病毒是经过50000g离心浓缩，TU值足够高，感染293T和MEF是没问题的，但表达GFP的mES克隆基本上没有。请高人给分析一下原因！另外，GFP的promoter是CMV, 这个是不是在mES当中表达很低啊，CMV \EF1-a\PGK\CAG\MSCV这些启动子在mES中哪个是最适合用的啊？

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本人开始也是使用含CMV启动子的载体，但在ES中转染效率非常低，于是使用由3中启动子合成的CAG，发现质粒的转染效率提高至少10倍以上。使用慢病毒载体，我使用过CMV \EF1-a\PGK三种启动子，CMV最差，EF1-a最好，PGK次之。根据我的经验，建议使用含EF1-a的慢病毒载体，我记得Invitrogen有售。含CAG的慢病毒肯定也会工作，但我没试过。另外做ES转染。不要用GFP，可使用Venus荧光蛋白，比GFP亮10倍，也是绿色。使用CMV启动子做其它干细胞转染，效果相对也较差。

深海寂寞鱼

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     to christophe战友：* K: f/ M8 M8 D" g& p# A/ U- i
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     mES中确实存CMV启动子的转基因沉默问题。
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     广 州 赛 业 前一段的培训中也提到过这个问题。) |, G( ^$ n. Y/ `

4 Y  P* {+ ?* z: z3 S     我们实验室Reading Report时我还讲过相关的一篇文献，我给你找找看，如果能找到我会上传到下面。
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4 g" |$ X7 H* s0 n' W     解决这个问题的方法是换用CAG或者EF1a启动子。
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. Y& M$ B5 Z1 k# K, Z, E     以上只是我对这个问题的一些初步了解，如果有问题欢迎继续交流。

christophe

回复 username 的帖子  O& p) O# u1 E

2 _$ y3 x' W3 c) f5 o谢谢你的宝贵经验！看来我需要换一下其他的启动子了。再麻烦问你一下，你做慢病毒转导mES效率能有多高啊，有什么关键步骤需要特别注意的吗？做慢病毒感染mES快两个月了一直不是很成功。

christophe

回复 深海寂寞鱼 的帖子1 q% S' }8 a. |! O5 I8 Y  x
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谢谢！那你了解CAG OR EF1a 比CMV在mES中的基因表达效率能高多少倍呢？我也找到一些这方面的相关资料，贴上来一起探讨一下。

christophe

在第二个资料是关于lentivirus转导hES的，在Page127 有一段话：When applying lentiviral vector-mediated transgenesis in hESCs, the most  critical  issue  to be  considered  is  the  selection of  a promoter. Another  critical  issue  is  the  selection method  for obtaining  a  pure  population  of  transfected  cells.

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回复 christophe 的帖子' n! N& i- S2 N. q( h5 u
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我做通常转染效率在60%左右（60%细胞表达GFP）。几点注意：1.我使用293FT包装细胞，而不是293T细胞，包装效率会增加一些，这细胞Invitrogen有卖；使用生长较好的293FT细胞包装。2.我使用Invitrogen出售的包装质粒，含三种质粒的混合。2.使用新鲜制备的病毒感染，mES也同时保持良好状态。3.使用悬浮细胞感染，总体积在1ml左右，感染3小时左右，每30分钟摇晃含细胞的离心管一次。我相信你的细胞感染效率低是启动子问题，换CMV后会改善。
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christophe

回复 username 的帖子- P$ B. d( ^* G; ^
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谢谢你的建议，你的效率真是挺高的啊！
# Y& S* t% `3 u# G我换一个启动子试一下，有了结果再交流！

Elaine韩

实验正好遇到此问题，总算找到组织了，呵呵。+ ~4 d" D; b7 e3 G0 G2 ^1 x
我想了解一下，是不是说在诱导过程中所用的SKOM四因子不用CMV promoter的vector？  @0 v* P" G; y1 m. h/ A4 l( _; B
看了上面的文献，假如我用CMV promoter的vector转染诱导成功的iPS,目的基因也会表达不强，是这个意思吗？
. [7 Z; g$ v6 l4 k& v但是实验室资源有限，现在手头有的就是CMV的，那该怎么办啊？自己重新构建？

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回复 Elaine韩 的帖子' E: }7 C+ X4 z; A& e
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制备iPS使用的是成纤维细胞等成体细胞，因此CMV是可以的，而转染ESC等干细胞时需注意启动子的问题。