慢病毒转导mES之promoter选择

christophe

最近用慢病毒向mES中转一个基因，病毒是经过50000g离心浓缩，TU值足够高，感染293T和MEF是没问题的，但表达GFP的mES克隆基本上没有。请高人给分析一下原因！另外，GFP的promoter是CMV, 这个是不是在mES当中表达很低啊，CMV \EF1-a\PGK\CAG\MSCV这些启动子在mES中哪个是最适合用的啊？

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本人开始也是使用含CMV启动子的载体，但在ES中转染效率非常低，于是使用由3中启动子合成的CAG，发现质粒的转染效率提高至少10倍以上。使用慢病毒载体，我使用过CMV \EF1-a\PGK三种启动子，CMV最差，EF1-a最好，PGK次之。根据我的经验，建议使用含EF1-a的慢病毒载体，我记得Invitrogen有售。含CAG的慢病毒肯定也会工作，但我没试过。另外做ES转染。不要用GFP，可使用Venus荧光蛋白，比GFP亮10倍，也是绿色。使用CMV启动子做其它干细胞转染，效果相对也较差。

深海寂寞鱼

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     to christophe战友：! y  |. r* h& a4 E  [0 f

8 N1 O! ?' u" N" |. m     mES中确实存CMV启动子的转基因沉默问题。
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! V7 T7 H5 j4 X0 ]3 [     广 州 赛 业 前一段的培训中也提到过这个问题。
6 D# t1 K  X$ C, \9 u1 f* t" R% ]# P9 @7 o" ~
     我们实验室Reading Report时我还讲过相关的一篇文献，我给你找找看，如果能找到我会上传到下面。0 }6 d$ g- W8 v7 c! L

8 t' q; E5 P# I# H8 _2 L( o     解决这个问题的方法是换用CAG或者EF1a启动子。9 C& \7 |* l" V) E5 N+ N; v

2 j" ?3 G5 o; {, S     以上只是我对这个问题的一些初步了解，如果有问题欢迎继续交流。

christophe

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2 {( n# E) X' t, b& q
% @  i  t! ?: p5 y2 n& [* Q3 g( J谢谢你的宝贵经验！看来我需要换一下其他的启动子了。再麻烦问你一下，你做慢病毒转导mES效率能有多高啊，有什么关键步骤需要特别注意的吗？做慢病毒感染mES快两个月了一直不是很成功。

christophe

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. |2 q3 U8 o. @9 h2 F  W5 p- r
- t' d2 R) U- |. o% N* U- e- @, m谢谢！那你了解CAG OR EF1a 比CMV在mES中的基因表达效率能高多少倍呢？我也找到一些这方面的相关资料，贴上来一起探讨一下。

christophe

在第二个资料是关于lentivirus转导hES的，在Page127 有一段话：When applying lentiviral vector-mediated transgenesis in hESCs, the most  critical  issue  to be  considered  is  the  selection of  a promoter. Another  critical  issue  is  the  selection method  for obtaining  a  pure  population  of  transfected  cells.

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3 W- ^1 F9 l3 ?  L* d
我做通常转染效率在60%左右（60%细胞表达GFP）。几点注意：1.我使用293FT包装细胞，而不是293T细胞，包装效率会增加一些，这细胞Invitrogen有卖；使用生长较好的293FT细胞包装。2.我使用Invitrogen出售的包装质粒，含三种质粒的混合。2.使用新鲜制备的病毒感染，mES也同时保持良好状态。3.使用悬浮细胞感染，总体积在1ml左右，感染3小时左右，每30分钟摇晃含细胞的离心管一次。我相信你的细胞感染效率低是启动子问题，换CMV后会改善。: ?3 b1 k- s( H1 u$ {# e1 x7 f! w

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christophe

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( x! T0 |' ^6 ~9 l4 s
: F3 F& l  ^2 ?+ \9 _  P谢谢你的建议，你的效率真是挺高的啊！
* k# e# V' C3 p" J% u我换一个启动子试一下，有了结果再交流！

Elaine韩

实验正好遇到此问题，总算找到组织了，呵呵。; ]# u" x. j- l4 R
我想了解一下，是不是说在诱导过程中所用的SKOM四因子不用CMV promoter的vector？
9 {  ]. J8 _$ K3 t# d& l' {看了上面的文献，假如我用CMV promoter的vector转染诱导成功的iPS,目的基因也会表达不强，是这个意思吗？; G; o$ ^3 s$ ?* I  p/ [3 d, w
但是实验室资源有限，现在手头有的就是CMV的，那该怎么办啊？自己重新构建？

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回复 Elaine韩 的帖子- |% O$ H; C) c0 j
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制备iPS使用的是成纤维细胞等成体细胞，因此CMV是可以的，而转染ESC等干细胞时需注意启动子的问题。