求助human MSC 培养

zhangmingqi111

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最近一直在做hMSC培养，通过查阅文献和在坛子里找一些方法，归纳起来MSC培养主要有贴壁和酶消化法。这两种方法我都尝试过，都养出来过，但是重复性很差，所以希望胞友可以帮助解决。下面我分别阐述这两种方法的问题：8 G- M/ C8 |) o$ E" |1 x) }# Q
一、贴壁法：个人感觉优点是细胞状态好，细胞较纯，但是缺点是时间长，不能保证每次都会成功。
1 N9 X# k5 h/ j/ A# U, E7 {4 D6 l每次在不经心的用贴壁法培养时细胞都会长出来，但是只要用心的，仔细去做，一个月以上的时间细胞也长不出了，真是很奇怪。我用的培养基是10%FBS+DMEM/F12，我每次做的时候是先把脐带中的血迹洗干净，然后剥离2根动脉和一根静脉，羊膜层尝试几次也没扒下来，最后统一放到离心管中剪碎。以前认为可能是剪切的太碎了，所以破坏了细胞导致细胞不生长，最近就直接用大组织块贴壁，细胞也没长出来。通过不断的实验，我发现贴壁时细胞也有方向性，胶质面朝下，细胞可能长出来的机会更多一些。

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第一张图为贴壁生长8天，第二张图为贴壁生长3天，100倍拍照

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第二种方法是酶消化法：优点可以获得大量细胞，但是细胞较不纯，杂质较多。' d  v- i: W+ c; w% _+ H) }
我们主要用0.5%的2型胶原酶消化，尝试过消化过夜，和消化2h，1h，4h。2h消化后，稀释过200目筛网，3000r/10min，离心后沉淀较粘稠，弃上清时总会有沉淀重新混在一起，然后直接加到T25flask中，10%fbs+DMEM/F12培养，镜下杂质较多，第二天观察时有细胞贴壁，但是杂质多。
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大少爷

脐带剪成小段后，剥开，去动静脉，把胶体剥下来就可以了，最好不带羊膜。

zhangmingqi111

消化2小时，可以看到贴壁的梭型细胞，但是杂质很多

zhangmingqi111

消化过夜，细胞无贴壁，杂质较多

zhangmingqi111

回复 大少爷 的帖子4 W5 i* Z/ W5 X% J! G! ^
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有的时候脐带非常的细，羊膜不好剥离，剥离羊膜后，胶体剩的非常少。

zgzjhzxyj

“每次在不经心的用贴壁法培养时细胞都会长出来，但是只要用心的，仔细去做，一个月以上的时间细胞也长不出了，真是很奇怪”。4 X1 r0 u& D3 s8 C3 S& t
没做过脐带的原代培养，我做的是从羊水中获取MSC，个人感觉，越懒越好，培养上去后就尽量不要去动它，除了必要的换液。等形成足够大的细胞克隆后，再做局部消化，根据细胞量决定培养瓶大小。（消化后我一般都先用六孔板培养，要是细胞量少的话，用24孔板，等细胞量够多了，再用培养瓶去养）这类细胞浓度低了就很难长，而且细胞状态也会差点。