关于REALTIME做标曲的问题

heiguzi1988

做real-time实验时，如果我想做的是相对定量，就是比较同一种昆虫同一种组织不同日龄段某一个基因的表达量关系，我只是需要相对定量来进行，那么我是否需要做到以下几点：! w1 U7 q# E' X( g/ w" F
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1、必须保证看家基因与目的基因的扩增效率接近，且都近于1？
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2、做看家基因和目的基因的标准曲线时，是否一定要以十倍的浓度梯度进行稀释呢？就是1、10、100、1000、10000、100000这样的稀释倍数来进行？因为我设计了几次引物，按这种方式，前三种浓度下融解曲线都还不错，到第四个浓度，（有的引物第三个浓度）便开始出现了融解曲线两个峰，就是引物二聚体出现的情况，如此也就影响了扩增效率，其实，我觉得，模板浓度被稀释得一定程度时，引物二聚体的出现是难免的。另外，我还将模板进行了一定程度的浓缩可是还是这样的情况出现，（这种浓度被稀释后出现二聚体的情况怎么避免，怎么可以做出漂亮的标准曲线来着？）所以，我想请问一下，是不是可以五倍的梯度做标曲？就是，1、5、25、125、625这样稀释呢？1 Y7 f1 ^# q  F/ D
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3、做检测RNA水平相对定量时，我是否需要在提完RNA，做反转录前调整各日龄RNA浓度一致的情况下再反转录成cDNA，进而利用这个cDNA来下一步实验，还是可以不用调整RNA直接反转录？因为我想用2-delta-delta法数据的分析工作，有的人曾提出，这种方法其实已经消除了一些不同一性，进行了归一化，但是，有的作者也说要，于是，我就有点不懂了，到底要还是不要调整RNA浓度呢？

jefferson

对于你问题的回答如下:8 H" B/ [* Q8 b# ?. n

1 \7 T; t  [/ X& P１．如果你用delta-delta　ＣＴ法进行结果分析，那么这种方法的默认条件即是目的基因和内参基因的扩增效率相同且为１，所以如果你的实际实验中扩增效率不相同，用该方法分析出来的结果会有所偏差；此外有更为严格的分析方法，Paffi法，只要扩增效率在９０－１１０％之间，允许两个基因的扩增效率不同，在结果分析时会将扩增效率考虑进去，从而达到归一化．5 E! Z$ r2 {& A# O0 q( ^! O

. R# z! y3 P5 y7 q8 ?0 z) R２．用于做标准曲线的标准品可以以任意梯度稀释，最重要的原则是，需要保证检测样品的Ｃｔ值落在标准曲线中最高浓度和最低浓度之间．也就是说，你可以连续５倍稀释（实际上，在进行内源基因表达检测时，连续１０倍稀释经常会遇到你所提到的情况，即后面几个浓度过低而导致引物二聚体的峰值较高，所以连续５倍稀释一般比较合适）甚至连续３倍稀释，只要最低浓度的标准品能扩增出产物，且样品的Ｃｔ值在标准品范围内即可．2 u4 G1 T6 H! o7 k: Z, N

3 }+ o1 Y) {, w5 K1 [$ n３，做相对定量时，必须首先在逆转录前对ＲＮＡ进行定量，这也是很多逆转录试剂盒中所要求的，如ＲＮＡ量为１ｕｇ，由于无法对cDNA进行准确定量，所以需要对ＲＮＡ进行定量，认为不同样本间的逆转录效率相同，因此获得的cDNA量也相同，进而进行定量分析，其结果表示在相同量的总ＲＮＡ中，不同基因的表达倍数关系．至于提到的delta-delta　ＣＴ法消除了一些不同达到了归一化，表示不很理解，个人认为，其更多的是指将PCR过程中不同的扩增效率进行了归一，都认为是相同且等于１的．其肯定不具有对ＲＮＡ量进行归一化的作用．

heiguzi1988

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7 t" q2 y) S4 P! }7 g, |) \+ q4 R! g1 G" |9 @& O
感谢啊！！！！！！

endless-caas

回复 jefferson 的帖子) `9 h3 F+ m9 l2 j
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我想接着请问一下，对于2中的做标准曲线，如果只是为了调整及验证内参与目的基因的扩增效率，那么对于你提到的标准品其实就是我需要做的样品的cDNA,而不是从公司买的标准品，对于这样的话，是否做5倍，或是3倍浓度的稀释再做标曲也行呢？0 x2 P/ u9 b9 H) m
如果这样标曲做出来，扩增效率达到了近乎1，是否就可以直接从这几个浓度中筛选出一个合适的条件进一步优化条件？

jefferson

回复 endless-caas 的帖子) g$ m/ I. l8 T! g* @1 L$ [1 F# L
9 z9 K: c1 `: r4 M6 m) [
如你所说, 在相对定量中, 标准曲线最重要的作用是监测扩增效率, 确保使用不同引物的目的基因和内参基因具有相同的效率, 这是批次内校正; 同时标准曲线也能在不同实验中进行批次间校正, 因为每一板PCR的扩增效率都不会是完全相同的, 因此通过标准曲线的监测, 通过严格的分析标定, 即可允许不同批次的实验结果间进行比较.
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, X" R4 w3 R' j0 C3 [( Q# V0 f3 @因此, 在相对定量中, 用于建立标准曲线的标准品没有特别的要求, 只要目的基因有表达, 样品中的任何一个都可以用来做标准品. 例如, 要比较某基因在正常组织和肿瘤组织中的表达差异, 正常组织和肿瘤组织都是样品, 同时, 可以在两者中任意取一个连续稀释, 用作标准品建立标准曲线., _+ S# W8 [! f/ A$ g9 X  b

% M  ^! }; ?! F$ @) J对于你的第二个问题, 我不太明白你所说的筛选出一个合适条件进一步优化是指哪方面的条件. 如果标准曲线的相关系数能达到0.99以上, 扩增效率接近1, 那整个PCR的条件就是比较稳定的了, 然后就是确定样品的稀释倍数, 因为要求样品的CT值落在标准曲线的最高和最低浓度之间, 一般来说, 如果连续5倍稀释, 样品可以稀释10倍, 稀释20倍也是可以的, 但由于稀释倍数越高, 微量操作时细微的差异导致的结果偏差越显著, 因此, 在允许的范围内, 样品的稀释倍数越小, 操作时产生的误差就越小.

ndwzf

能否给我们讲解一下Paffi法呢？

endless-caas

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: a: I. N& N! I3 Y0 H/ U( R' a( _- |) c
OK，原来如此，第二个问题的解答正好是我想问的，可能我没有问清楚，但是你的确是答到的就是我想知道的。就如你所说的，相关系数及扩增效率都达到了满意的程度，PCR条件就已经可以算是稳定下来了，这中间也就应该是包括了模板的浓度这一条件也稳定下来了吧？这样做样品试验时，就应该考虑模板的浓度在这个浓度左右，所以必须反转录前调整RNA浓度在我们这个稳定PCR条件所用cDNA前的RNA浓度。或者可以直接每次调整浓度的时候，在每一板间用一个相对好调的浓度，只要Ct值能在标曲的最高与高低之间就行呢？

jefferson

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这里不能输入公式, 没办法把整个公式打出来.( G, c, A6 f! o3 i1 X  b
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具体算法是, 首先计算出Delta Ct, 然后以扩增效率为底数, 以Delta Ct为幂计算结果. 分别用这种方法计算出目的基因和内参基因的指数结果, 然后以目的基因指数结果除内参基因结果就可以了. % K5 ]' B4 [* n# B% T+ d5 o
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这种方法允许目的基因和内参基因有不同的效率, 且将其考虑在内. 其实Paffi法就是考虑了扩增效率的Delta Ct法. 也就是说, 当扩增效率是Delta Ct法中默认的相等且等于1时, Paffi法就简化成了Delta Ct法.