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免疫缺陷小鼠-人慢粒白血病模型 % @; l- p3 y: s" ]4 w
Sawyers等[1]研究发现来源于慢性粒细胞白血病患者急变期的瘤细胞能够在SCID小鼠身上繁殖，白血病细胞在转移到无造血功能组织之前主要分布在骨髓、外周血，与其在人体内的分布极其相似，而CML患者慢性期的瘤细胞却难以在SCID小鼠体内成活。1996年Chrstian等[2] 报道先以400cGy射线照射SCID小鼠，再种植CML慢性期和急变期病人的白血病细胞。他们从12 位未接受化疗的慢性期CML患者的新鲜骨髓和外周血中分离出白血病细胞，将8-14×107白血病细胞从尾静脉输入经亚致死量射线照射的SCID小鼠，一些小鼠还适时注射细胞因子，并伴随注射PIXY321及c-kit配体。移植后30-90天，处死小鼠。用包含人bcr外显子1特异的DNA的探针进行Southern免疫印迹分析或流式细胞仪检测，发现大约70%人CML细胞在移植后的SCID小鼠体内为Ph-细胞。无论是用CML患者的骨髓细胞还是外周血细胞移植SCID小鼠，ph+细胞检测水平很相似。 Wang等[3]人同时用慢性粒细胞白血病细胞种植SCID小鼠和NOD/SCID小鼠，结果发现NOD/SCID小鼠优于SCID小鼠。NOD/SCID小鼠是通过SCID小鼠与NOD/Lt品系（TL、BL、NK细胞缺陷，循环补体缺乏，抗原呈递细胞分化及功能不良）回交得到的NOD/Ltsz-SCID/SCID小鼠（简称NOD/SCID小鼠）。由于其缺乏功能性NK细胞，CML慢性期的细胞，尤其是加速期和急变期细胞更容易移植成功。对移植后NOD/SCID小鼠骨髓中CD34＋集落形成细胞（CFC）进行分析，发现71%为ph＋CFC，Southern免疫印迹分析发现细胞存在bcr重排，而SCID小鼠的CFC仅有17%ph＋CFC，且因移植后白血病细胞浓度太低而无法进行Southern免疫印迹分析。这一发现不仅证实慢性期CML病人的骨髓及外周血中同时存在正常干细胞和白血病干细胞，还证明其中部分细胞具备体内分化能力[4]。
: P j- } y6 i' w: b+ T( X9 i( tLewis等[5]分离新近诊断为慢性粒细胞白血病慢性期病人的外周血细胞，利用单克隆抗体分析检测CD34、CD33、CD3、CD19表达，并分选出CD34阳性细胞，从尾静脉注射经过300cGy照射的NOD/SCID小鼠（6-8周龄），一些小鼠还适时注射人重组造血生长因子（HGF）。8至50天处死小鼠，用人特异探针进行荧光原位杂交和流式细胞术分析小鼠的骨髓细胞和脾脏细胞。结果表明，在注射4×107个CML细胞的小鼠中，有84%的表现出较高水平的移植，其中46%小鼠在骨髓中检测到超过10%的人细胞，而且无论是单独使用或联合应用细胞因子SCF、G-CSF，GM-CS都不能提高移植的水平。Sirard等[6]曾以8-14×107新鲜慢粒病人外周血细胞或骨髓单核细胞移植到SCID小鼠体内，发现大部分小鼠仅检出0.1-10%的人细胞，而接受2-6×107细胞的SCID小鼠体内不能检测到人细胞。这些研究表明移植 SCID小鼠需要大量CML细胞，相比之下 NOD/SCID小鼠的成功移植仅需较低剂量的CML细胞。
4 N9 M) r2 A- E. w! P+ ?免疫缺陷小鼠-人慢粒白血病模型存在一定局限性[7]，因为小鼠协助造血细胞分化和成熟的细胞因子、粘附分子和胞外基质与人类不完全相同，目前尚无法实现在免疫缺陷小鼠体内完全重建人类造血功能。
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2 b* U; ^6 B+ p$ a q1 \2 _5 {( b4 N表达P210bcr/abl逆转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞并移植正常鼠
7 J4 K. i; c5 r9 b( HDaley等[8]分离雌性BALB/c小鼠的骨髓细胞，用表达bcr/abl融合基因的逆转录病毒载体转染，筛选后注入到5只6-12周龄经致死剂量（900cGy）照射的同源雄性BALB/c小鼠体内，观察到小鼠出现CML相关症状以及急性淋巴细胞性白血病。
( k% ^0 w- U# p! F: Q; J- }) p0 I! hKelliher等[9]采用v-abl或bcr/abl逆病毒载体转染小鼠造血干细胞，经过筛选后,以1×105个细胞/鼠注射到接受致死剂量照射的同源小鼠体内，发现无论abl基因的形式如何，均有90%小鼠发生肿瘤。在这些小鼠中有大约50%小鼠表现异常骨髓增殖，与人慢性粒细胞白血病慢性期的特征有许多相似之处，而其余的小鼠则表现为B淋巴细胞异常增生。Kelliher认为该实验模型有助于了解激活状态下的abl基因是如何影响CML造血干细胞功能的。; ^' b4 C+ S/ R, W5 m6 T1 ^
Gishizky等[10]分离用氟尿嘧啶（5-Fu）（150mg/kg）预处理的雄性BALB/c小鼠骨髓细胞，并以 P210bcr/abl基因逆病毒载体转染，按1-2×105细胞注射到接受致死剂量照射的同源雌性小鼠体内。根据发病的潜伏期是否大于20周，将实验小鼠分成两组。潜伏期大于20周的小鼠表现出粒细胞异常增生，造血功能紊乱，从这些小鼠身上分离的细胞，可有效地移植到经照射的同源小鼠体内，复制CML，表明转染bcr/abl基因的鼠骨髓细胞具有高度再生能力，可用来模拟人慢性粒细胞白血病。
# G" b( I* H1 V; Q" \0 l在上述研究者的工作基础上，Warren等[11]采用MSC逆转录病毒载体，提高表达bcr/abl融合基因的病毒滴度，实验发现CML潜伏期大为缩短，所有接受转染细胞的小鼠经过4-6周潜伏期后都发生CML。主要变化有外周血白细胞显著增多，脾脏肿大，bcr/abl融合蛋白大量表达。但用这种方法构建的CML动物模型与人CML还有一些差异，如大多数 CML模型鼠往往在短期内迅速死亡，没有经历类似于人CML的慢性期，而且肺部出血现象很明显，这在人类CML很少见。
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# H! x6 u. A O7 [6 Nbcr/abl转基因小鼠模型& ^0 u5 ]6 p6 ^7 Y7 r
人们对bcr/abl转基因小鼠的实验尝试要追溯到上世纪80年代后期。Hariharan等[12]发现难以利用全长bcr/abl cDNA，于是他们采用人bcr基因与V-abl基因融合来代替进行研究，以bcr启动子调控P210bcr/abl蛋白的表达，而bcr/abl融合蛋白的表达对小鼠的胚胎有致死性[13]，而且bcr/abl转基因小鼠出现的急性 B淋巴细胞或者T淋巴细胞白血病。Hariharan等[12] 改用含免疫球蛋白重链增强子或MPSV长末端调控bcr/abl融合基因制备转基因小鼠。一些转基因鼠经一定潜伏期后发生B淋巴细胞白血病、T淋巴细胞白血病。不过bcr/v-abl不同于bcr/abl，因为前者缺乏bcr/abl起源区片断，所以该转基因小鼠还不能准确地反映BCR/ABL融合蛋白的生物学特性。为了克服这一问题，Honda等[14]采用metallothionein(MT)启动子建立表达P210bcr/abl的转基因小鼠。他们发现该转基因小鼠及其后代都发生急性白血病。通过流式细胞术检测和Southern免疫印迹分析表明为T淋巴细胞白血病，并能检测到P210bcr/abl表达和异常增强的酪氨酸激酶活性。同年Voncken等[15]也发表了用MT启动子成功构建P210bcr/abl转基因小鼠的报道，但转基因鼠皆发生急性淋巴细胞性白血病。这些实验说明尽管P210bcr/abl转基因小鼠为人类PH＋白血病提供了模型，却难以模拟人CML慢性期的病理变化。另外bcr/abl融合基因在转基因小鼠组织中分布广泛[16]，也会影响疾病的发生和发展。
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发表于 2011-7-9 19:12
发表于 2011-7-10 10:25
