请教骨髓间充质干细胞分离培养的方法

yishengyouwoly

先说说我们实验室的方法：+ `4 W; J( a& O. [! \
参照《细胞培养》这本书里，具体采用全骨髓培养方法。7 Z; U! S3 b% O. e7 A
培养方法" e/ a; l, a0 K9 m7 {+ j3 N& b; Y" p
1、选用4w雄性sd大鼠，取股骨胫骨，去干骺端，冲出骨髓，用pbs离心（1500转，4m），培养液（hyclone FBS 10%+DMEM F12+双抗）重悬细胞，悬液加入塑料瓶两只里培养。7 C# G% P1 d' v, t; n
2、接种后2天左右首次换液，采用全量换液，以后每2-3天换液，8天左右传代。传代用2.5%胰酶，弯头滴灌吹打。一瓶传三瓶。' M' M- `1 u& ?" T# m. w
培养效果：4 f: _0 o, y- ]/ W  C
细胞不纯，有多种形态细胞。细胞出老化和分化，在2-3代时候细胞不呈梭形，呈多角形，发出很多触角，不知道是什么细胞。
, c& E7 J7 \3 G9 ]5 }疑问：$ j/ {! z8 C6 M% V. h
1、有没有更好的培养方法？效果怎样？7 c4 h5 C7 r; `  t
2、怎样获取纯度更高的细胞？2 |, q) H8 n% N% A
3、怎样维持干细胞梭形形态，减缓分化时间？0 {% |% _8 C* I# |( @% E
谢谢

liuerfu

取股骨胫骨后，一定要去除干净骨头外的其他肌肉，骨膜，不然会有很多杂细胞。6 p0 x, f9 Z  U
离心可以采用密度梯度离心，离心时间可以长一点。15min。
) L6 u: Z# h  d* z8 P& w血清可以用GIBICO的，防止分化。
3 X! D' W7 Q5 D1 Q5 G

liuerfu

http://www.stemcell8.cn/thread-43269-1-1.html
5 b- i& T, r$ B2 d8 R/ a  Z! o$ f可以看看他们的方法
' q" h# q" |; Y, K6 b6 H

yishengyouwoly

谢谢两位战友

yishengyouwoly

回复 liuerfu 的帖子; Z5 a+ Y& _9 ]

- g$ i8 G* v5 v! l# ]( Y和你的头像有点神似，谢谢你的建议

liuerfu

大家都是新手 以后互帮互助0 Y( S% _) D# Z" _# l( v: I+ j- `* X6 A

yang179

根据血量，如果血量太少，离心一下去除上面的油脂层，用红细胞裂解液裂解红细胞，因为红细胞太多贴在底部形成红细胞层会影响细胞的贴壁；如果血量有达到10ml左右，建议用ficoll分离，然后贴壁培养，换液时间我一般是4-5天。后面的就是普通细胞培养的方法。

痞子的烟头

1301918986

回复 liuerfu 的帖子4 K. m8 q5 p' W# u# l
+ f( ~9 ~) g; g9 Y/ {' V* k8 }
呵呵，请问进口血清养的细胞效果明显吗？我现在用的的国产血清养的效果不太好，很容易老化。

1301918986

回复 yishengyouwoly 的帖子7 C) y( U: @% w  `! }
) V5 \0 k; B* [* a. s
你传代用的胰酶浓度有点大吧，一般都用的0.25%的。