为什么检测miRNA要用茎环状结构的RT引物？

如来的观音

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1、如题，为什么用随机引物不行？是不是因为miRNA太小了，但是茎环引物的miRNA3’端也有6到8个反向互补碱基，岂不是也占据了miRNA的很多碱基（miRNA分子太短~22 nt）？
2 q  f  m9 Q+ d3 D9 }1 R2 Z2 h2、或者说茎环引物和随机引物都可以，只是茎环引物逆转录来的cDNA毕竟比随机引物得来的量产更多。( T4 C3 n% u; y" b* @
3、如果两者都可以，随机引物RT得来的cDNA还没有生成的引物二聚体产量高，影响检测结果
' c* D; S: y$ ~$ f# S: J* Y4、还有逆转录得来的cDNA是不是带有引物在上面，次外加引物不需要出去吗？不会影响接下来的PCR吗？

runsong

. @* B$ Q0 ?$ R2 `1 c& ?- N: c' e
      通过PCR检测目的片段必然要求目的片段有合适的长度。miRNA所对应的cDNA太短，无法设计PCR引物，势必要求在反转录阶段对cDNA进行加长。这一点是随机引物不能满足的。6 W- T) c( x8 g8 |3 V
      miRNA的反转录是准特异性的，即特异性地反转录末尾与RT引物末端6到8个碱基反向互补的RNA，注意这是通过两个条件使RT引物和miRNA拼合成完美的发卡结构，此结构稳定性高，可以大幅增强特异性，miRNA的cDNA产量就随之提高了。5 e: j7 h; ~9 m* N" ~& B
      反转录得到的cDNA是RT引物顺着miRNA反转录得到的，反转录完成后体系中会残留很多未参与反应的RT引物，为了不影响接下来的PCR，必须使上游引物末端与RT引物末端不能有超过2bp的重合，否则RT引物就会成为模板参与PCR反应。
1 z4 a/ C! f5 B' S& B& d      希望我能解释清楚，不过楼主的文字写得有点随意，有的地方我没读通。

191225092

回复 runsong 的帖子. e) D: f# ?$ m4 p7 G

. d! m8 l: p2 h5 [- A3 A8 Crunsong您好！本人最近在做microRNA的定量，用的是茎环引物加SYBR GREEN法，在做反转录PCR时，空白对照（用DEPC水代替RNA）总是会出现非特异扩增，您的一些帖子中说“为了不影响接下来的PCR，必须使上游引物末端与RT引物末端不能有超过2bp的重合，否则RT引物就会成为模板参与PCR反应”，但我发现很多文献中的RT引物与上游引物都会有超过2bp的重合，我的也不例外（我的引物是从BMC genomics的一篇文章中找的，自己也另外设计了一对pcr引物，但都会有非特异扩增），为何他们的都没提到说有非特异扩增，而我的每次都会有。非特异扩增的条带不是很亮，大小与实验组相当。如何减少非特异扩增？不知您有无解决的方法？还望赐教！感激不尽！

runsong

回复 191225092 的帖子' x5 c; |5 \" Y  I& i" F
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我快毕业了，最近比较忙。你把你的手机号码发到邮箱5595758@163.com里，电话里说吧。其实我设计的引物也不太好。至于那一条是我自己揣摩的，没有文献支持。