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回复 yangpan521 的帖子
8 X* g; @- `. F8 }/ J% O6 i2 M2 X
5 [ z/ J, V) S3 J我的意思是培养人最初是在幼儿园啊。呵呵。不好意思。我也是初学者。知道的很有限。我没有要笑话你的意思。
. |# ~ j+ M) A7 [看来你是做人的胚胎干细胞的培养。呵呵。
, F- e: ~8 U# I4 f, M
2 c' s! E: w3 M# [# P) f以小鼠的为例啊。请参考。
( O! s( [$ {9 c" Q组织块培养法：" T' f( s9 a: T" W" e3 {
1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将胚躯干剪(切)成1mm3以下 的碎块,吸置于离心管内。
5 Q* j/ r4 S' }2 u: X5 S# s2) 室温下静置5～10min, 弃上层液，留下胚胎组织碎块。
$ k7 T+ V$ W6 j7 }; X3) 向装有胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。. D- Y9 G" O6 _4 y4 }
4) 加入等体积的培养液终止消化。室温下静止5-10min。
/ V$ v% U8 s) A* Z7 y x5) 弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物。6 T/ K, T3 `2 V9 u. Z
6）加入 5ml培养液重新悬浮胚组织块,移入培养瓶内。每5个胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。. k- A2 n9 _% F. n0 h
7) 补加适量的培养液,使组织块悬浮液能均匀分布于培养瓶表面。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。, s( g" r( O$ g2 v$ d9 {
8) 培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见组织块附着培养瓶表面, 周围生长出细胞。补充培养液或更换培养液,继续培养。每天观察。$ Q6 V3 D3 S$ C0 Z4 W
9) 待细胞连成一片时,即可消化。消化时弃培养液,用PBS洗涤一次；加适量消化液（以能覆盖细胞层 为度），在室温下作用大约30sec；弃消化液，让残余消化液继续作用。轻敲培养瓶底, 当细胞层出现裂隙时，加入培养液终止消化。或在倒置显微镜下观察，当细胞与细胞之间分开即可终止消化。6 ~0 j r: S1 ?& X" t
10）补加培养液，轻轻吹打均匀，吸置离心管内，静置5～10min。
, p$ \. e8 I( N: S2 W6 z) Q11）上层为单细胞悬液,下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内,弃组织块。& z: n7 B+ s, v) @# E, @
12）以800～1000rpm 5min离心，弃上清。加入培养液,重新悬浮细胞沉淀。以1:3比例传代。采用3～5代细胞作为饲养细胞。, u- D0 u9 V. G# ?3 @9 a+ @
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发表于 2011-8-24 09:45
发表于 2011-8-25 13:37
