CMV启动子在干细胞中的沉默

runsong

都说CMV启动子在干细胞中会被渐渐沉默掉，通过转基因方法诱导干细胞分化时都不用CMV启动子启动外源基因。
5 }8 g6 i* _& K真的是这样吗，机理是什么呢？2 t9 g2 X; f. S3 Z/ l2 U' j
CMV启动子在哪些细胞中适用呢？
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jefferson

runsong 发表于 2011-8-31 23:30   T2 s: X4 ^$ O
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0 p4 e5 n/ n9 H谢谢提供宝贵经验，想再问两个问题

! j3 h$ C4 [& D0 R8 L& m1. 对于外源mRNA的丰度我无法给你确切数据, 因为实验是之前做的, 而且当时做的是RT-PCR, 不是Q-PCR, 没有定量, 只是定性的看到能够扩增获得外源mRNA的条带, 其亮度比内参条带弱一些.
0 A1 E! ~% s  }2 |! k% o. R2 _/ M+ S2 J1 X" H
在我们的实验中有mRNA转录但没有翻译, 如果说是因为CMV起始的转录获得的mRNA不能加工成成熟稳定的结构, 那在你的实验中, 即便你只需要获得miRNA就可以, 但是CMV起始转录出的70bp左右的前体miRNA能否加工剪切为成熟的20bp左右的功能miRNA, 这就不确定了. 所以即使你不需要有蛋白表达, 但问题可能依然存在.
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7 V9 F; N0 h( U& d4 u3 S& L当然这个只是我的猜测, 要确切证实是否可行, 最好能做下预实验, 感染ES后检测下miRNA的表达. 如果你有了相关结果, 希望能告知我, 分析下这个问题到底出在哪里.
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# \* I0 |- M! }6 T9 p) c0 H' v: L2. 在目前讨论的几个启动子中, 包括你提到的那个帖子中, CAG启动子是在很多ES相关论文中都报道使用过的一个启动子, 其在ES细胞中的效果不错; EF1a启动子也是很多论文报道在ES中使用过的, 也是没问题的; PGK启动子曾经看过一篇文献, 用这个启动子在ES细胞中过表达一个基因, 结果跟我们的CMV一样, 有mRNA但没有蛋白., t( P8 z' e, g  X6 X
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所以, 如果你有CAG和EF1a的启动子, 在ES中是肯定没问题的

fguw

据我所知，CMV在HESC，HIPSC 活性都很低，可能是这些细胞所有的类型转录因子类型比较特别，没有足够的特定转录因子结合启动子，所以活性很低，但是分化的细胞，比如皮肤细胞，血液细胞，CMV就有很强的活性，; n2 B: U; B% V9 Z5 K: z1 B' l, d
就我所知（不一定对），CMV在除了HESC，HIPSC 以外，活性都很高（如果需要了解不同启动子在不同细胞活性，大家可以查查文献）, ?: h# U8 G  x7 L: @" n3 @

jefferson

这个问题有点复杂
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6 y: @' ~8 ~1 b9 ]( J+ X8 q很多论文中提到CMV不能在ES细胞中调控基因的表达, 我们之前也做过这方面实验, 将CMV启动子调控的外源基因整合到了人ES细胞中, 但是发现外源基因编码的蛋白不表达, 或者表达量低至无法检测. 然后检测其mRNA, 却发现有外源基因mRNA的表达, 表达量也不算弱.
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所以这个原因就不好解释了. 因为CMV作为启动子, 其功能是起始下游基因的转录, 我们能够检测到外源基因的mRNA, 说明CMV启动子能够起始转录. 但无法检测到蛋白, 说明转录的mRNA未能翻译, 而翻译过程和CMV是没关系的. 一个可能的原因就是CMV在ES细胞中起始转录获得的mRNA不能加工成为成熟稳定的mRNA进行翻译, 所以才导致我们的结果. 这个仅仅是我个人猜测, 不能证实.
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) q" a# w4 i$ X# T9 \  {0 n) M7 d8 LCMV驱动的其他基因在ES细胞中不表达, 是否也是同样的情况,即有mRNA转录而没有蛋白翻译, 我们没做进一步的实验. 所以对于大家观察到的现象,即CMV在ES中不能起始外源基因表达到底是CMV被沉默了还是其能够起始转录只是转录的mRNA有问题不能翻译, 需要更多的实验来证实. 也期待能有准确的答案.
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% O9 m- o4 E; U2 ~) y2 j如果说CMV在ES中确实不能发挥启动子的作用,个人觉得最大的可能原因就是其启动子区内的甲基化修饰发生了改变而导致的. 可能CMV启动子区更易于被甲基化,从而导致其功能的丧失.
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另外第二个问题, CMV作为一种广谱的强启动子,在大部分成体细胞中都能表达, 我们在很多肿瘤细胞系以及原代细胞中都验证过.

runsong

; w) R: a( l  W' F  G# M' Q; z4 \7 O. L5 m% o. k5 {$ B
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5 t  T+ v/ B; ?8 c/ Z/ e" Y( H% A* f7 n+ b
谢谢提供宝贵经验，想再问两个问题
  O$ s: v5 `; g! X1、你们检测的外源基因mRNA的表达量大概是多少。由于我们有自己构建的由CMV启动的miRNA超表达慢病毒载体，只需要转录出RNA这一步就行了。所以想知道外源RNA确切的表达丰度。! Y. f0 \6 j! J0 H! X7 G( o
2、我们有含CAG启动子、EF1a启动子的慢病毒载体，这两个载体在ES细胞中表达吗？
  N2 K. m! ^! `5 b

runsong

没想到这个问题已经被人问过了% v5 ?7 h0 X: c, _0 a
http://www.stemcell8.cn/thread-42835-1-1.html9 v* q1 A8 G( K/ @) B3 M- V
这里的讨论还是很有水平的

fguw

jefferson,还是做了不少工作的，嘿嘿，! F" ~% k2 R" D7 L1 G
我觉得可能的确与mRNA不稳定有关系，
- f% F' r; C+ ]5 {" ^另外，CAG（CMV enhancer with a chicken beta-actin transcription start site and a rabbit beta-globin intron） 启动子，在HESC里活性很高，该启动子在CMV基础上加个 ACTIN transcription start site and  Globin intron, 所以可能对mRNA稳定有提高，所以导致CAG的高活性，当然，需要试验来验证

Elaine韩

实验正好遇到此问题，总算找到组织了，呵呵。
  N0 v8 u. c. [$ v' h我想了解一下，是不是说在诱导过程中所用的SKOM四因子不用CMV promoter的vector？
( H: l4 M% ]0 y8 u, j8 r2 r看了上面的文献，假如我用CMV promoter的vector转染诱导成功的iPS,目的基因也会表达不强，是这个意思吗？" ^7 O& J9 C7 j: k9 c
但是实验室资源有限，现在手头有的就是CMV的，那该怎么办啊？自己重新构建？

runsong

应该不能用CMV启动子。/ G3 q* F3 C* |3 P6 K5 p+ s
我已经向一位老师求赠含有CAG启动子的慢病毒载体，应该能得到赠送。
, G" c. Q5 E9 K. O. y& z- j你要是想要的话就联系我，我再和老板商量。

llecstem

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3 t3 J) ~3 o) \8 A4 q. S7 T7 D3 o3 M5 F2 |7 F* O6 v+ }* i% t
你好，想问个问题，你有没有检测过在小鼠ES，CMV的表达情况，比如B6 ES，谢谢！