求助：在培养BMSC期间遇到的问题

李1二

我从去年5月左右就开始培养BMSC，取原代后两三天细胞均贴壁呈长梭形长得很漂亮。但是不知道怎么回事，最近两个月以来，取原代后培养液呈很浑浊的黄色，像洗了肉的水一样，因为我用的是直接冲洗骨髓腔200目筛网过滤后不离心直接培养的方法，细胞不纯，可能是里面的其他细胞死亡悬浮造成，但问题是基本上没有贴壁细胞，换液两次后就只能扔掉。操作和去年一摸一样，所用的试剂也相同。
! C) p% ^8 M& i5 _9 w1 z+ ^6 O1.处死4-6周SD大鼠，酒精浸泡5-10分钟。
( m- d7 o8 v- x$ _9 U' a5 N2.取股骨、胫骨，剔除肌肉筋膜，浸泡在含双抗的PBS内。
1 w" |, d3 @; w5 N3.进一步剔除骨表面附着的骨膜，剪开两端骨骺，用注射器吸培养基冲骨髓腔，收集。1 `" i7 y! O: o/ A1 ?
4.200目筛网过滤，（前两天试了一下在这个地方加上离心5*1000转/min好像效果要好一点，离心后吸弃上清再加入培养基制成单细胞悬液），吸入培养瓶中。% v" J* r4 F; v  M1 S  Q5 P) W) \
拜托各位给点意见，帮我分析一下问题出在哪里。! H& m1 |' H/ b' y5 n. m9 T
非常感谢！
3 n7 s8 f" {, f) G; x

褚cell

污染的可能性极大！可以考虑换一下培养液等。
) Y' I3 |6 ^/ ]& K6 c1 O( ~

fengxuechunyang

原因可能：; i2 V' ^* U, a( ~" S5 d* l4 c
1 直接的骨髓培养，其中的杂细胞太多，影响干细胞贴壁；尤其是血细胞破裂后就成黄色可能。& O* T. G  v/ J: u
2 可以试试密度梯度离心法，这样去除杂细胞，比较干净，但是要用淋巴细胞分离液。+ Y& z* g" [0 w
3有可能培养基或血清出了问题，以前见到这样的问题，查批号，只好换厂家了。

henryjia

我觉得90%是污染原因造成，即便有RBC破裂，多数时候看到细胞碎片而不至于浑浊像洗了肉的水一样！- `' ]( t# E/ F0 Z. V
; j) K, k7 l& P  v( @2 W
有可能FUNGI，真菌污染，双抗不一定有效。建议彻底清洁除菌消毒通风橱，恒温哺育箱。更换培养液。* D, v+ `7 W- n4 W* p/ g

8 }% j, F: k5 j! o/ K+ m如果担心血清或培养液有污染，可以用0.22um过滤膜消毒后在使用。

stand_up

首先确定楼主是什么时候发现培养液变黄色的浑浊液的，如果短时间内观测到很明显的浑浊可以初步肯定是细菌的污染，细菌污染后会引起大量的细胞死亡产生碎片，而且细菌生长速度比较快，基本上2-3天就发现培养基有明显的颜色变化，并且培养基成浑浊

李1二

回复 fengxuechunyang 的帖子7 x0 n. Z* F& G$ z
: }8 q5 M5 F" r8 b# b
杂细胞影响干细胞贴壁的话首次换液在第几天最好？  因为经费问题去年那一批用了淋巴细胞分离液  今年就没用了  可能跟我用的血清有关？？不是胎牛血清是新生牛血清……

李1二

回复 henryjia 的帖子
& S! p( m6 E3 l% p! N
% {  J# j* q' [2 Q我就是应该把这些问题都解决了才能真正找到问题

李1二

回复 stand_up 的帖子6 T- s. [* w" J

. o. I# ^4 v! b/ O5 F就是2-3天最混浊

meister

浑浊，可能是污染了， 也可能是死亡细胞太多， 建议1.分离后培养， 2. 测试各个培养成分，培养基，血清，有无细菌污染

fengxuechunyang

胎牛血清和新生牛血清的质量是不一样的，建议用胎牛血清；培养基和胎牛血清都有真假的，要仔细鉴别；还有就是小批量的细胞培养，建议用小包装的，因为不管什么试剂打开时间长了都有影响，比如培养基的PH值；还有就是要做到严格无菌的，滴管，什么的，培养箱里不行的细胞赶紧扔掉，否则就是污染的源头。不过关健的大家认为还是血清和培养基。