求助：在培养BMSC期间遇到的问题

李1二

我从去年5月左右就开始培养BMSC，取原代后两三天细胞均贴壁呈长梭形长得很漂亮。但是不知道怎么回事，最近两个月以来，取原代后培养液呈很浑浊的黄色，像洗了肉的水一样，因为我用的是直接冲洗骨髓腔200目筛网过滤后不离心直接培养的方法，细胞不纯，可能是里面的其他细胞死亡悬浮造成，但问题是基本上没有贴壁细胞，换液两次后就只能扔掉。操作和去年一摸一样，所用的试剂也相同。  A! ^- G1 b2 k8 @. h6 y& i$ t& Y
1.处死4-6周SD大鼠，酒精浸泡5-10分钟。' [9 Y: @4 L3 U7 H- E1 a
2.取股骨、胫骨，剔除肌肉筋膜，浸泡在含双抗的PBS内。& T4 A' r& d* ~& t6 N+ g
3.进一步剔除骨表面附着的骨膜，剪开两端骨骺，用注射器吸培养基冲骨髓腔，收集。
! |# W/ o& L1 C# a4 ^4.200目筛网过滤，（前两天试了一下在这个地方加上离心5*1000转/min好像效果要好一点，离心后吸弃上清再加入培养基制成单细胞悬液），吸入培养瓶中。
( Q' W" l( Y# j5 ?拜托各位给点意见，帮我分析一下问题出在哪里。
# o) Z; `2 K" z1 X) s2 ]非常感谢！
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褚cell

污染的可能性极大！可以考虑换一下培养液等。( M% u' a2 Z8 C. n/ Z

fengxuechunyang

原因可能：- l/ r' m4 Q' d9 u
1 直接的骨髓培养，其中的杂细胞太多，影响干细胞贴壁；尤其是血细胞破裂后就成黄色可能。' X  l" L' {% T
2 可以试试密度梯度离心法，这样去除杂细胞，比较干净，但是要用淋巴细胞分离液。
' ]# [* W; Y* [1 d" [; X3有可能培养基或血清出了问题，以前见到这样的问题，查批号，只好换厂家了。

henryjia

我觉得90%是污染原因造成，即便有RBC破裂，多数时候看到细胞碎片而不至于浑浊像洗了肉的水一样！7 ~) y* b$ E4 d7 }1 B. G

8 t+ ?4 I" Y% w# b有可能FUNGI，真菌污染，双抗不一定有效。建议彻底清洁除菌消毒通风橱，恒温哺育箱。更换培养液。- j) g' i" N5 f1 `+ _

7 b6 Q6 U+ e1 y5 z0 {1 T' B如果担心血清或培养液有污染，可以用0.22um过滤膜消毒后在使用。

stand_up

首先确定楼主是什么时候发现培养液变黄色的浑浊液的，如果短时间内观测到很明显的浑浊可以初步肯定是细菌的污染，细菌污染后会引起大量的细胞死亡产生碎片，而且细菌生长速度比较快，基本上2-3天就发现培养基有明显的颜色变化，并且培养基成浑浊

李1二

回复 fengxuechunyang 的帖子( ?/ Y+ D8 M+ [: F# E/ l, R) Q
- w8 t' L. @% ^' B
杂细胞影响干细胞贴壁的话首次换液在第几天最好？  因为经费问题去年那一批用了淋巴细胞分离液  今年就没用了  可能跟我用的血清有关？？不是胎牛血清是新生牛血清……

李1二

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8 {+ H% T! ^- e, r: @. }
, Y# V  S' L' h7 F我就是应该把这些问题都解决了才能真正找到问题

李1二

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4 Y7 m9 b+ A0 D* u
就是2-3天最混浊

meister

浑浊，可能是污染了， 也可能是死亡细胞太多， 建议1.分离后培养， 2. 测试各个培养成分，培养基，血清，有无细菌污染

fengxuechunyang

胎牛血清和新生牛血清的质量是不一样的，建议用胎牛血清；培养基和胎牛血清都有真假的，要仔细鉴别；还有就是小批量的细胞培养，建议用小包装的，因为不管什么试剂打开时间长了都有影响，比如培养基的PH值；还有就是要做到严格无菌的，滴管，什么的，培养箱里不行的细胞赶紧扔掉，否则就是污染的源头。不过关健的大家认为还是血清和培养基。