干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

 

 

搜索
朗日生物

免疫细胞治疗专区

欢迎关注干细胞微信公众号

  
查看: 20610|回复: 9
go

求助:在培养BMSC期间遇到的问题 [复制链接]

Rank: 2

积分
72 
威望
72  
包包
905  
楼主
发表于 2011-10-6 21:20 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我从去年5月左右就开始培养BMSC,取原代后两三天细胞均贴壁呈长梭形长得很漂亮。但是不知道怎么回事,最近两个月以来,取原代后培养液呈很浑浊的黄色,像洗了肉的水一样,因为我用的是直接冲洗骨髓腔200目筛网过滤后不离心直接培养的方法,细胞不纯,可能是里面的其他细胞死亡悬浮造成,但问题是基本上没有贴壁细胞,换液两次后就只能扔掉。操作和去年一摸一样,所用的试剂也相同。
! C) p% ^8 M& i5 _9 w1 z+ ^6 O1.处死4-6周SD大鼠,酒精浸泡5-10分钟。
( m- d7 o8 v- x$ _9 U' a5 N2.取股骨、胫骨,剔除肌肉筋膜,浸泡在含双抗的PBS内。
1 w" |, d3 @; w5 N3.进一步剔除骨表面附着的骨膜,剪开两端骨骺,用注射器吸培养基冲骨髓腔,收集。1 `" i7 y! O: o/ A1 ?
4.200目筛网过滤,(前两天试了一下在这个地方加上离心5*1000转/min好像效果要好一点,离心后吸弃上清再加入培养基制成单细胞悬液),吸入培养瓶中。% v" J* r4 F; v  M1 S  Q5 P) W) \
拜托各位给点意见,帮我分析一下问题出在哪里。! H& m1 |' H/ b' y5 n. m9 T
非常感谢!
3 n7 s8 f" {, f) G; x
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 20 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 20   查看全部评分

Rank: 2

积分
53 
威望
53  
包包
255  
沙发
发表于 2011-10-6 22:28 |只看该作者
污染的可能性极大!可以考虑换一下培养液等。
) Y' I3 |6 ^/ ]& K6 c1 O( ~
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
169 
威望
169  
包包
869  
藤椅
发表于 2011-10-7 05:12 |只看该作者
原因可能:; i2 V' ^* U, a( ~" S5 d* l4 c
1 直接的骨髓培养,其中的杂细胞太多,影响干细胞贴壁;尤其是血细胞破裂后就成黄色可能。& O* T. G  v/ J: u
2 可以试试密度梯度离心法,这样去除杂细胞,比较干净,但是要用淋巴细胞分离液。+ Y& z* g" [0 w
3有可能培养基或血清出了问题,以前见到这样的问题,查批号,只好换厂家了。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 10 + 20 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 10  包包 + 20   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
664 
威望
664  
包包
40  

金话筒 优秀会员 帅哥研究员

板凳
发表于 2011-10-7 06:41 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
我觉得90%是污染原因造成,即便有RBC破裂,多数时候看到细胞碎片而不至于浑浊像洗了肉的水一样!- `' ]( t# E/ F0 Z. V
; j) K, k7 l& P  v( @2 W
有可能FUNGI,真菌污染,双抗不一定有效。建议彻底清洁除菌消毒通风橱,恒温哺育箱。更换培养液。* D, v+ `7 W- n4 W* p/ g

8 }% j, F: k5 j! o/ K+ m如果担心血清或培养液有污染,可以用0.22um过滤膜消毒后在使用。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 10 + 20 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 10  包包 + 20   查看全部评分

Rank: 2

积分
62 
威望
62  
包包
928  
报纸
发表于 2011-10-7 10:43 |只看该作者
首先确定楼主是什么时候发现培养液变黄色的浑浊液的,如果短时间内观测到很明显的浑浊可以初步肯定是细菌的污染,细菌污染后会引起大量的细胞死亡产生碎片,而且细菌生长速度比较快,基本上2-3天就发现培养基有明显的颜色变化,并且培养基成浑浊
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
72 
威望
72  
包包
905  
地板
发表于 2011-10-8 22:36 |只看该作者
回复 fengxuechunyang 的帖子7 x0 n. Z* F& G$ z
: }8 q5 M5 F" r8 b# b
杂细胞影响干细胞贴壁的话首次换液在第几天最好?  因为经费问题去年那一批用了淋巴细胞分离液  今年就没用了  可能跟我用的血清有关??不是胎牛血清是新生牛血清……
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 1 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 1  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 2

积分
72 
威望
72  
包包
905  
7
发表于 2011-10-8 22:37 |只看该作者
回复 henryjia 的帖子
& S! p( m6 E3 l% p! N
% {  J# j* q' [2 Q我就是应该把这些问题都解决了才能真正找到问题

Rank: 2

积分
72 
威望
72  
包包
905  
8
发表于 2011-10-8 22:37 |只看该作者
回复 stand_up 的帖子6 T- s. [* w" J

. o. I# ^4 v! b/ O5 F就是2-3天最混浊

Rank: 4

积分
1322 
威望
1322  
包包
3387  

专家 优秀会员 金话筒

9
发表于 2011-10-9 09:38 |只看该作者
浑浊,可能是污染了, 也可能是死亡细胞太多, 建议1.分离后培养, 2. 测试各个培养成分,培养基,血清,有无细菌污染
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
169 
威望
169  
包包
869  
10
发表于 2011-10-11 05:53 |只看该作者
胎牛血清和新生牛血清的质量是不一样的,建议用胎牛血清;培养基和胎牛血清都有真假的,要仔细鉴别;还有就是小批量的细胞培养,建议用小包装的,因为不管什么试剂打开时间长了都有影响,比如培养基的PH值;还有就是要做到严格无菌的,滴管,什么的,培养箱里不行的细胞赶紧扔掉,否则就是污染的源头。不过关健的大家认为还是血清和培养基。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 10 + 20 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 10  包包 + 20   查看全部评分

‹ 上一主题|下一主题
你需要登录后才可以回帖 登录 | 注册
验证问答 换一个

Archiver|干细胞之家 ( 吉ICP备2021004615号-3 )

GMT+8, 2025-6-15 18:22

Powered by Discuz! X1.5

© 2001-2010 Comsenz Inc.