做wester-blot为什么用his抗体做不出来

hailanlanyj

我最近构建了一个his-neuritin质粒，在信号肽后面加入6-HiS，然后把这个质粒转染入细胞，做Wester-blot，用His抗体鉴定这个蛋白表达没有，但我用his抗体却没有做出来，不知道哪里出问题了？/ U( m  D/ B$ W9 V6 o# ?3 W! m
  先介绍一下我这个蛋白即有信号肽也有GPI瞄定位点，但我是按照膜蛋白来做的，按理说信号肽是要被切掉的，这样我的标签就露出来了，这样就可以抗体鉴定，但现在我却找不到原因，请大家帮我分析一下吧？急啊

殆死悲爱

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& l: u0 s: x, \# k9 K/ X2 m+ l, x' w1 r+ P6 i
你咋可以肯定你构建的质粒在细胞中表达，而且还锚定到了膜上？

zxcv12345

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& f" H! i3 ?, o6 @8 e/ ?4 k: c: S, L
做 western blot，蛋白变性了，跟histag暴露与否无关，+ U/ v$ k+ k4 _0 L; |8 u
. `' _0 B9 h* ~2 O4 N
有三方面可考虑
9 g' w( R* V& n* p7 G1 W0 Y2 Y" o1蛋白是否表达
  G" u" @& a: [2是否被降解, {* w' @$ p2 a' C" |3 z
3是否分泌到细胞外

bjman10016

如果是要分泌到细胞外的话，检查一下是否表达了但没有分泌出来。另外有些His-tag抗体做WB不行，可以换个抗体试试。

john7812x

你可以先做SDS-PAGE，看看蛋白是否表达，然后再做WB。3 D2 r9 y& ^" ~: `
WB不出现结果的原因，楼上几位分析的很对。我要补充的是：你的蛋白大小和你选择膜的孔径是否一致？若蛋白小，膜孔大，转印时，蛋白就漏掉了。

jieniao1

你可以买个histag 阳性对照，我刚开始的时候也是用his，免疫荧光中能看到点东西，但是westblot 中什么也没用，然后买了个阳性对照，后来得出结果是，阳性对照有，因为我表达的东西太少了，你也可看看6his protein ladder, 买这个做阳性对照。

slgracie

本人之前也有做过his标签的WB，却发现非特异性条带很多，后来打电话咨询公司，被告之his标签抗体太小，不是很稳定，如果载体上有其他标签，建议再尝试下哈。祝好运！