求免疫荧光的染色流程

wang1234611

免疫荧光。

minshuyin

我做免疫荧光的步骤：0 b8 y3 h, e' e
1.PFA（多聚甲醛）固定15分钟；
: I6 ?! A% V; w, F! e4 T' W2.吸去PFA，用PBS洗3次，每次几分钟；) Z/ x/ N$ N2 i6 u0 Y
3.Triton-X 100破膜10分钟；
+ |& u2 F2 H) N4 u& X4.PBS洗3次，每次几分钟；
" z! P& L7 N1 y5.1%BSA封闭30分钟；
; v4 |% A& P3 l) Q6 J* ^4 v6 i6.吸去BSA,加入一抗，4度过夜；; f& u' s& N" a7 d, m
7.吸去一抗，用PBS洗2-3次；" w" P$ f; a7 ~# s1 _
8.加入二抗，室温或37度一小时；/ j3 F  f+ ^! S0 }( X
9.吸去二抗，用PBS洗2-3次；
3 ~. C' N5 s7 x3 S  J# ~10.加入PBS，照相。- e5 D# \3 D- O
+ h8 ]6 E/ k, r
不知道说的是不是清楚，不明白的再问我~

shihuijunm

荧光免疫组织化学方法
* b$ Z+ N" c4 ]（1）        细胞爬片：用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化液消化单层培养细胞，用含10%FBS 的高糖DMEM培养基重悬细胞，以密度为5×103个/mL，将细胞悬液均匀种入六孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。) ?8 Z! V! v* K+ O
（2）        细胞固定：取出盖玻片，PBS液浸洗，置于4%多聚甲醛固定液中室温下静置固定15min，蒸馏水冲洗3次。7 g, m+ |1 d$ L3 |. @
以下操作均在湿盒中进行
6 V! @# m) z. d8 J（3）灭活内源性过氧化物酶：30%H2O2　 1份＋纯甲醇50份混合，室温浸泡30min，蒸馏水冲洗3次。（该步骤可以省略）
& v% [& q- t3 _, ?9 N0 x! y% J3 B（4）逐渐滴加山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，不冲洗。
2 r$ [; G, D7 {: |（5）滴加稀释后的一抗，均匀铺在玻片上，置于湿盒内放置4℃冰箱过夜。  Z; N- n" t/ o+ O
（6）PBS冲洗3min×3次,滴加荧光二抗，室温2h，PBS冲洗干净，硝酸甘油封片。* [  Z) ~& n( v9 L9 U, L( P( e8 z
（7）激光共聚焦显微镜观察荧光强度及着色部位。
( j6 f9 y, T: h+ q  p2 U

mzyysmile

7 }2 [. w' g  p5 y+ C: }) U/ U
* p) F( w9 |' x7 J1 m
补充一点。。。两种抗体加完后，在mounting之前，我们会用DAPI或Hoeschst 做counterstaining标记细胞核。

mirrornight

一起学习了，谢谢

yanlu98

1.PBS洗三次，每次3min
" T% Y- _" m' i9 r0 K/ h# R2.多聚甲醛固定，室温20-30min
, V( l& R* }6 b, J) L3.PBS洗三次，每次三分钟
- x$ [  ]! ^+ r3 g6 H4.弃去PBS，加4%BSA4℃过夜（也可以室温30min）/ Y1 q' _# o; Z0 \: i7 F; M
5.加一抗，4%过夜（个人经验：4%过夜效果比37℃1h更好）
4 S; O% }7 j. @2 P% O6.弃去一抗，PBS洗三次，每次三分钟4 R+ U& y- y: ^' R. P  W
7.加二抗，37℃1h或室温4h或4℃过夜（一定要注意不能干燥！）: U/ Q* e$ I8 c& j) c* m! i* D
8.弃去二抗，PBS洗三次，每次三分钟0 A- Q* k* ~6 s+ k' |8 H( C7 t
9.加DAPI核染，5min，避光（从此步开始，以下均需在避光条件下进行）" s/ n# G$ T! q6 e# R0 T+ ]" ]7 a
10.用重蒸水洗，三次，每次三分钟
& s' `( n$ O% B( J. K# E% g+ F11.加少量重蒸水，保持标本不干即可) c9 F; |+ W0 x9 V
12.观察，拍照。$ D+ a# {- O; L% u+ W6 c# G2 N
（个人操作步骤，希望能帮到你啊！）

lingminliang

        (1)PBS洗1次，5分钟；
' M& |8 U; B6 P1 v        (2)  4%多聚甲醛室温固定40分钟，PBS洗3次，5分钟次；& m, L0 _# w" Z) l' g9 F$ f/ a
        (3)  含0.3%Triton-100X的PBS室温作用45分钟，PBS洗3次，5分钟/次；8 b" b& p9 p  {' A/ x+ l  p: J9 z
        (4)  5%封闭液用正常羊血清室温孵育45分钟，抑制非特异性染色背景产生；) g& T* B: k7 U: X* \) j9 T9 d. [$ n
        (5)  吸去封闭液，加入一抗4℃孵育过夜；
& \4 p- u0 \7 f$ ^1 k        (6)  次日， PBS洗3次，5分钟/次；% U/ z, Z1 K: H! o7 L  E* _$ C
        (7)  加入荧光二抗室温避光孵育2.5小时；$ j9 H$ @! C3 O, `/ {" q( P" @
        (8)  PBS洗3次，5分钟/次；5 Q; o6 w& F( Q5 c+ T" X
        (9)  加入DAPI细胞核染料，室温避光孵育10分钟；
4 V; e" j3 {# j, S% b3 j1 W        (10)  PBS洗3次，5分钟/次；$ J3 R$ j$ V4 k7 y- l' l, N
        (11) 荧光显微镜下观察并照相。

懒孟

是不是封闭液也有好多种？根据什么选择封闭液啊

细胞海洋

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8 d2 S. G) `" V" B8 Q+ s# C建议你发新帖提问

amphioxus

实验前：免疫荧光前做取卵，放培养箱中培养，具体做什么时期卵根据实验需要+ v. X& \1 B$ G, S! [
免疫荧光步骤：9 p  [: `" O' S+ e
1固定通透（PFA起固定作用，Triton-X 100起通透作用）* Q8 o: @( @+ h; S* D
固定液1ml 4%PFA+0.5%Trton X-100混合液 37℃  45min
/ p" s, [6 c6 @8 W2洗  PBS-PVA洗3次，每次10min: w( W( f5 P. o% J
3封闭 1%BSA封闭4℃过夜
! r5 V! h: F$ _, [4孵育一抗  根据实验敷你用的一抗 4℃冰箱放12h5 A, |4 g7 K6 s2 M6 S7 B
5洗  0.02%Trton X-100 洗3次，每次20min
0 m7 ~" Y* N" U* R* u- l6孵育二抗  根据实验敷你用的二抗  避光  室温1h# Q3 A( |, v. E5 I
7洗  0.02%Trton X-100 洗3次，每次20min  
9 e" Z- r4 H# z5 M. A8压片 加用2ul DAPI染DNA后压片，然后放在荧光显微镜下观察。
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