流式 求助

zz091115

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( h8 R3 t: |  S  u8 I# e
  P/ a2 {6 \! k, I3 c加抗体之后再封闭你有作用么...封闭就是为了封住非特异性结合位点 要么使用抗体前加 要么干脆你就别加了 这样加你不是浪费么...

zz091115

回复 leisong12 的帖子! |% u/ T/ E- d  n) T7 a5 s

! u. e( y+ Q9 a/ t4 C" s个人感觉不是很必要加 你做western的话 一种抗体对一种抗原 当然要封闭来准确定量 但是你是做流式鉴定surface markers确定细胞群的话 通常你不会只用一个染色就确定 用三染甚至更多荧光颜色的话 非特异性结合同时发生影响你的结果的概率就很小了 如果你想追求非常严谨或是钱多那就另当别论了...

zz091115

回复 leisong12 的帖子0 p( P2 ~  e1 F. _- s. y

6 `6 l1 J6 M+ p1 Y1 p9 b直标一抗我觉得不需要 你测定通常都是三种甚至更多的marker 同时发生非特异性结合的概率很低

zz091115

奇怪了 为啥我的回复自己看不见

chutu

FcR主要在NK、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞等表达。如果检测的细胞中包括这类细胞，应该先用FcR Blocking Reagent封闭，否则FcR介导的标记抗体吸附会很严重，造成假阳性结果。因为血清中存在大量抗体蛋白，所以可以起到封闭FcR的作用，尤其是同种属的血清。对于其它大多数细胞，表面没有FcR, 但由于表面电荷作用或者其它吸附作用的存在，细胞会非特异地吸附抗体，造成一些弱的染色，用BSA或血清封闭，可以减弱非特异的抗体吸附，这就是封闭的意义。不过实际上非特异的抗体吸附很微弱，封闭不封闭一般情况下可能看不出多大差别，除非很精细的实验

827914734

回复 zz091115 的帖子. F. R# c- q! X7 j6 `

2 C1 W: o$ ]% b7 V# {& B我做的也不是很多，现在主要是沿用师兄师姐的做法，我觉得仅用一抗进行标记时封闭效果有限，而且非特异性结合也可以用同型对照去除吧，我们的封闭是在洗去抗体时进行，个人觉得抗体孵育时间过长也好增加非特异性结合的机会，用血清封闭应该也会减少非特异性结合的机会，当然从这个意义上讲也许标记前封闭效果会好一些。一抗封闭，说有多大效果未必，完全浪费也未必，主要是自己没做过这种对照，不好下定论。我也是新手，还请前辈指教。

zz091115

回复 827914734 的帖子$ }# F4 n6 w0 H6 d% ]
1 A2 I, W: E' ^
各自有各自实验室的习惯 这个不好统一 让楼主自己去摸索吧...

细胞海洋

回复 zz091115 的帖子% V( ]' ]# u1 ?( j4 l

& T* L! _1 S1 u% N翻页 第二页了

leisong12

我觉得可以结合zz091115和chutu两位的观点，实际操作中可以做个预实验，看看一抗标记荧光的封不封闭差别大不大。我们用三色确定细胞群的不多，见过临床上分血细胞是三色标记的。如果只用一种荧光标记的抗体，如分选已知表面标记的肿瘤干细胞，用BSA还是和抗体种属来源相同的血清封闭呢，或者干脆用牛血清封闭，现在也是不知怎么弄才好。

dyg108

; W4 [  w5 g4 B& w/ k
, ^) Z) e1 S- N最好的答案就是按照你试剂的说明书来做。流式细胞术技术非常复杂，不同的试剂，或针对不同抗原的抗体做法是不能统一的，这一点非常重要。如果想做到最好，那么连PBS等一些配备的耗材最好也用说明书上给推荐的产品。, k9 x) n8 j* s. l( I9 T
当然，一般BD的产品是没有封闭这一步的，但洗涤所用的PBS里要加有BSA，这样有时候自己配洗液就可以了，不用非买产品推荐的洗液。如果效果不好，那么可以考虑严格使用说明书上的步骤和推荐产品。
2 J. t( V2 B% g1 }$ I其实一般情况下不使用BSA可能会使得道指增大，图形不太好看，但结果影响不大。为了严格建议使用BSA，但浓度不用太大。