求高人指教啊！关于iPS诱导方面

YLL824WAN

小妹刚开始做iPS方面，又没有师姐和老师的指导，所以糊里糊涂的，看了一些文献，还是有很多搞不清楚啊！还希望各位高人在此多多指导一下哦！谢谢啊！（1）就是在诱导iPS过程中，用病毒转导靶细胞后三天左右孔板就长满了，要用什么消化传代呢？我上次用胰酶消化的，之后去看荧光，背景全是绿蒙蒙的很模糊；（2）病毒感染靶细胞后大概多久要换成hES培养基呢？（3）什么时候把转导后的细胞种于MEF饲养层呢？是要等克隆出现之后挑克隆吗？克隆大概会多久出来啊？多谢高人赐教啦！感激不尽啊！

song58

个人经验：# C# B% r" n5 ^+ h; @/ r4 \/ @" L8 r7 V
1、胰酶消化' c' y% q: r/ E7 N& L
2、接到feeder上就能换hES Medium( I) b0 Y7 q; K9 q' A
3、看细胞状态，通常不超过6天，有时候两天就上feeder了。最好是把克隆挑出来，否则用酶消化再接到新板子里时杂细胞太多，影响克隆生长。OSKM的话一般要20天左右能看见克隆。! h* b% C4 s. O5 t: s& ^

* M7 z& X) D3 }希望我的经验对你有帮助

YLL824WAN

song58 发表于 2011-11-28 16:25
# a6 B+ \8 M3 ^( Z/ U9 N! h个人经验：
% Z  R  M  Q! \9 `1、胰酶消化
9 y( U4 F4 {6 r) u$ x5 X2、接到feeder上就能换hES Medium

" I) N3 A% i: g7 s
你的意思是说，病毒转导靶细胞不超过6天，也就是克隆还未形成时就用胰酶消化后种于MEF饲养层上，等克隆出现了再挑出来养，是吗？

michaelgibh

病毒感染第二天将培养基更换为DFBS培养基，感染第五天复苏饲养层细胞，感染第六天用0.05%胰酶消化后计数，感染后第22天~30天挑克隆

song58

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& H) V1 }5 W$ b: \* R( w/ u) I5 j( \
是的。

YLL824WAN

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, R0 p  v8 l& F. E) v3 T+ ^- O2 ?2 P
3 U. g7 @5 c9 Q; ^" z  k5 Z好的，多谢啊！呵呵

song58

回复 YLL824WAN 的帖子5 W; w% J9 x; y2 s: N
# p- u& Z7 |: R6 ^% z
嘿嘿
  p! i+ ~4 V9 V不客气

YLL824WAN

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6 E1 {# R$ k; N2 l
/ K: _- H9 U- h( O+ i" `* z对了，还想麻烦你一下哦！想问问你用的是什么hES培养基啊？是不是所有iPS培养都需要用MEF饲养层啊？我买了mTeSR培养基，听说好像可以用BD matrigel养而不用MEF饲养层，但我又不敢确定，所以想再请教一下啊！多谢多谢啊！呵呵

song58

回复 YLL824WAN 的帖子6 i) p- c5 A! t* Q

5 k) ?5 H* g5 s4 O我用的hESM就是最普通的：DF12，KSR，NEAA，Glu，2-Me，bFGF。有时候加双抗，bFGF有时候从4加到10～20ng/ml。  W' M5 {2 _* i- e, e- F
mTeSR是加拿大StemCell公司的产品，和Matrigel联用就不用MEF了。但是我个人感觉，这个培养体系养成系的细胞（比较皮实）应该没问题，做iPS我就不知道了...
: M" s" r1 d! H& V$ p' o: h; @另外，我做过的iPS都是靶细胞过量的情况，多余的靶细胞就相当于feeder了，而且克隆挑出来也是直接往feeder上接，还真没尝试过feeder free的做法。你试试，结果到时候跟我们分享一下呗:lol

jefferson

首先不清楚你用的什么病毒诱导的, 慢病毒还是逆转录的; 其次不知道你感染的什么细胞, 种属, 类型等等, 不同种属, 不同类型的细胞, 诱导过程和方法都是有区别的...* J) |! t. P# M0 z/ Z' @
: |% j1 k) r$ j- d
以逆转录病毒进行感染诱导人的皮肤细胞为例说下个人意见吧.* b8 B9 y6 f0 {* O& x+ E+ @; ~
1. 诱导时起始细胞, 即HDF细胞的接种密度对诱导的成功率很关键. 不能种的太密, 按你的说法, 感染后两三天就长满了, 考虑是否是接种过密了. 即便你是参考的文献报道数据, 也要考虑是否你细胞计数存在较大误差. 因为目前主流的Protocol都是建议感染后第6天转到MEF上, 也就是说, 之前这6天是不需要传代的. 而且有报道, 前面几天中细胞间的接触产生的信号转导, 对iPS的诱导是有利的. 如果你的细胞增殖能力很好, 你多次计数没问题, 用的文献报道数目接种, 依然很快就长满了, 就需要考虑提前接种至MEF上, 因为太密的话细胞就开始凋亡了. 不过一般都建议第6天用胰酶消化后计数接种MEF.  F  i8 Z4 W) W1 u) d
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2. 看你采用的是哪个Protocol,  这里的方法也有很多种的, 大多人在第六天接种MEF后就换ES培养基, 7天后由于MEF可能已经不行了,后续采用条件配养基进行诱导培养, 直至克隆出来; 也有其他的方法, 如裴端清教授实验室的Protocol, 接种MEF后就用称为DFBS的培养基培养大概18天, 再换ES培养基. 如果你刚开始做, 严格按照Protocol进行.
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% _4 g' ]! h1 f% s3 X" c3. 如第一点, 一般建议第6天转MEF, 有的方法里, 用四因子诱导最早可以在第9天就看到出现细胞团的隆起, 14天左右就有克隆出现, 20多天就能挑克隆. 如果用三因子(去掉C-Myc), 效率和克隆形成时间都会降低和延长. 诱导过程中, 建议持续培养至挑克隆, 中间不进行传代. 如果发现MEF不行了,就用条件培养基进行培养.