RNA探针合成问题咨询

heiguzi1988

现要合成RNA探针，用SP6转录。但是操作过几次效果都不好。+ Z! m3 w# ^1 z# {* d0 D
分析原因有：DNA模板不纯，后经过试剂盒纯化处理（两次）260/230能到1.8以上。感觉应该合格。8 N6 E& w! p, w* }$ m) z# S  w% r
但是我查到一些论坛，说用来做RNA探针的DNA模板最好也去除RNASE。
1 Y5 J1 ]6 L1 z但纯化试剂盒的elution buffer应该就是普通的超纯水吧，不是RNAse-free的水，如之奈何？用这种DNA模板做出来的RNA探针，电泳图有好多散带且主带不亮，不知道是降解的原因还是啥原因。
- a( ^, R# L2 w0 Z- z2 M请问怎么纯化DNA模板至RNASE-FREE又纯度很高？是不是在最后一步加DEPC处理的水就行了，感觉还是不合适，因为试剂盒本不是为RNA所作。（我是想知道有什么传统方法？）
! w* W# Q; a/ Y- \  G6 t8 b还有，需不需要再纯化RNA探针之后才能用来做杂交呢？
1 h  i: x% O. F% L  y, h谢谢！

ilovelife

我用作RNA探针的DNA模板是用试剂盒纯化的，最后一步也没有用DEPC水洗脱。合成时加了RNAase 抑制剂，合成后用0.1体积的4MLiCl/2.5体积的100%乙醇沉淀。没有跑胶观察，但做了一次原位，效果还行。

ambassador

ilovelife 发表于 2011-12-15 08:07 + ^& [& F. G! D. ^6 l! ]
我用作RNA探针的DNA模板是用试剂盒纯化的，最后一步也没有用DEPC水洗脱。合成时加了RNAase 抑制剂，合成后用 ...

/ \7 K8 Z# O7 g1 R+ l. [1 v你做的是原位杂交？有没有进一步做Southern呢？因为Southern要经过转膜，杂交等诸多步骤，期间RNA探针是不是会降解就不得而知了~求教！0 R- v1 H3 B1 Z5 h: s% i; U- I
另：你是怎么做原位杂交的？就用PCR产物转膜后杂交显色就OK了？

ilovelife

回复 ambassador 的帖子/ T# c6 F0 b! f5 c2 K: Z! O
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你好。
; Q, M% [4 }: B, v我做原位杂交是用组织切片做的，主要是对mRNA 的杂交，探针是用Dig标记的RNA 探针。首先将要研究的组织固定，制备冰冻或石蜡切片， 然后经过一系列的处理，主要目的是暴露mRNA，使探针能够充分接触，增加杂交机会，同时尽量降低背景。  j. b1 J* O6 \/ t5 G

" R; s4 o  P3 n6 J4 `9 G; h8 I8 m我也做过Northern，转膜什么的是挺麻烦的，要极度小心，能用DEPC处理的都处理，而且要注意不能用裸手进行任何操作，所以我是能避免做Northern就避免，后来都用RT-PCR代替了，反正有原位做后盾呢。
( @6 Z2 E. @- e5 g, \5 D  R9 s. z# l/ b; C6 i
做Southern我用的是P32标记的DNA 探针，不怕降解，做起来不用那么束手束脚，感觉好多了。
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以上只是我的一点经验，一家之言，有机会可多加探讨。: Z0 u) Z+ f6 [: }- b' d3 i  ?' A

栀子花开

你转录的时候有没有加RNase inhibitor啊？5 I5 v& N0 p9 O4 Q
毕竟在转录体系中你加入的模板的体积有有限的，其他大部分体积还是要DEPC处理的水来补充，所以我感觉DNA模板要求RNase free比较难。
& `8 u% t, B; v) T" m只要在转录的过程中，加入一定量的RNase inhibitor，还是可以保证转录的有效性的吧。
& k: P8 a3 @) q& @楼主可以试下的。